陳建勇，郝芳艷，林近秋，田曉鵬，王素格

（1華北醫(yī)療健康集團邢臺總醫(yī)院內五科，2邢臺市人民醫(yī)院消化內科，河北 邢臺 054000）

肝纖維化是肝細胞對慢性肝損傷后作出的一種自我修復反應，屬于多種肝病逐漸發(fā)展為肝硬化的重要中間階段[1]。肝纖維化在肝損害后的肝臟修復過程中會伴隨細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的大量合成，使得肝內ECM 出現過度沉積。研究證實肝纖維化早期具有一定逆轉可能性，進行及時有效的治療具有重大意義[2]?？ňS地洛可以通過阻滯交感神經受體，發(fā)揮成纖維細胞增殖抑制作用，從而降低ECM 合成量，改善肝纖維化[3]。肝纖維化進程中常伴隨炎癥及機體免疫反應，且兩者會進一步加重肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[4]。Toll 樣受體4（toll-likere?ceptors4，TLR4）-髓樣分化因子88（myeloiddifferentia?tionfactor，MyD88）-NF-κB（TLR4-MyD88-NF-κB）作為參與機體固有免疫的重要信號通路之一，其與酒精性肝纖維化發(fā)生發(fā)展存在密切相關性，其可通過激活機體炎癥反應誘導腫瘤壞死因子α（tumornecros?isfactor-α，TNF-α）、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6 等下游炎癥因子大量合成和釋放，但目前關于該信號通路在肝纖維化病程發(fā)展中的作用尚且研究不多，且卡維地洛是否通過TLR4-MyD88-NF-κB信號通路改善肝纖維化尚且需要進一步研究證實[5]。為探討卡維地洛對肝纖維化的抑制程度及作用機制，以及肝纖維抑制作用與給藥劑量之間的關系。本研究以SD大鼠構建肝纖維化動物模型進行相關研究，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料選擇60 只清潔級雄性SD 大鼠（動物來源：廣東省醫(yī)學實驗動物中心），鼠齡12月左右，大鼠體重（200±15）g，按照清潔級大鼠飼養(yǎng)要求進行飼養(yǎng)，大鼠自由進食食物和水。藥物卡維地洛購自上海麥克林生化科技有限公司（批號：20190122）。試劑：抗體TLR4、MyD88、NF-κB均購自Abcam 公司，批號分別為ab13556、ab2064、ab16502）；抗β-actin 購自康為世紀公司，批號為20190215；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、TRIzol試劑購于北京柏萊斯特科技有限公司；ELISA 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；主要儀器：電泳儀（廠家：上海天能科技有限公司，型號：EPS300），熒光定量PCR 儀（廠家：美國ABI 公司，型號：ABI7500），Modulus多功能光度計（廠家：美國BioSystems公司），顯微鏡（廠家：日本Olympus公司）。

1.2 模型建立與藥物干預方法將60只大鼠隨機分為空白對照組、模型組以及低、中、高劑量卡維地洛組，每組各12只。采用膽總管結扎法建立模型組和卡維地洛組大鼠肝纖維化模型[6]，并于造模成功后48 h開始，分別灌胃給予低、中、高劑量卡維地洛組大鼠卡維地洛藥液0.5、1.0、1.5 mg/kg/d，均分2次給藥，連續(xù)給藥4 w；空白對照組和模型組每次給予同時等量蒸餾水。

1.3 各組大鼠血清學指標水平測定干預7 d后從各組大鼠眼眶取血1.5 mL，2 500 r/min離心15 min（有效離心半徑10 cm）后得到分離后血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒測定各組大鼠血清樣品中ALT、AST、ALB以及炎癥因子IL-1、IL-6、TNFα水平和Hyp、LN、PIIINP含量。

1.4 肝組織病理學觀察給藥干預4 w后，在無菌操作條件下切取左葉肝組織5 mm×5 mm×5 mm，然后使用多聚甲醛（4%濃度）將肝組織固定并進行常規(guī)石蠟切片，完成切片制備后進行HE染色和Masson染色。鏡下觀察各組大鼠的肝臟組織結構、肝細胞炎癥、變性壞死以及纖維化增生情況。

1.5 Western-blot法測定皮損組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平在無菌操作條件下剪取各組大鼠左葉肝組織各3塊，約100 mg/塊，經超聲裂解后采用BCA法對蛋白進行定量，使用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白樣品進行分離后，將蛋白轉移到PVDF膜上，使用封閉液將樣品于室溫下封閉1 h，將膜轉入封閉液稀釋的一抗（TLR4、MyD88、NF-κB稀釋1 000倍），以β-actin為內標。然后于4℃條件下孵育過夜后使用洗液進行洗滌，化學發(fā)光法顯色，X射線底片曝光。

1.6 實 時 定 量PCR法 檢 測NF-κB與TLR4/MyD88 mRNA水平取出大鼠肝組織并加入TRIzol試劑將細胞完全裂解，并于室溫條件靜置5 min。然后加入氯仿200μL于裂解后細胞中，渦旋20 s后再于室溫條件下靜置5 min。取靜置后樣品放入離心機中在12 000 rpm條件下離心15 min，將上清液轉移于EP管中并加入異丙醇0.5 mL，混勻并于室溫條件下靜置10 min。然后使用Prime Script RT reagent Kit反轉錄試劑盒（購于賽默飛世爾中國公司）將總RNA進行反轉錄。NF-κB、TLR4、MyD88引物序列分別為正向5'-A C AC GG ACA GGATT GACAGA-3'、反向5'-GGAC ATC TAAGGGCATCACA-3'；正 向5'-CAAT?GACATTTCACACACGCAG-3'，反向5'-AGATGGAG?GAGGTCTCGCAG-3'；正 向 5'-TGGCAGTGTCT?TAGCTGGTTG-3'，反向5'-G C G A G C A C A G A A TT A ATACGAC-3'。PCR反應條件：95℃60 s，95℃15 s，60℃15 s，72℃15 s，連續(xù)循環(huán)42次，并于72℃條件下延伸10 min。最后均采用2－△△ct計算組 織 中NF-κB、TLR4、MyD88 mRNA相 對 表 達 量（RQ）。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件對本研究不同組別各項指標間差異進行評價。其中計量資料以（±s）表示，采用獨立t檢驗，計數資料以%表示，采用χ2檢驗，多組間采用方差分析，組間兩兩比較采用SNq檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝纖維化大鼠模型驗證造模后，HE染色結果表明：對照組大鼠肝小葉結構完整且有序排列，肝索形態(tài)清晰可見，肝細胞未出現明顯的變性或壞死，以及未見明顯增生纖維組織。模型組大鼠肝組織大部分肝小葉結構被破壞，肝細胞出現明顯水腫、變性甚至壞死，炎性細胞大量沉積，肝索結構和形態(tài)混亂。Masson染色結果表明：對照組大鼠肝小葉結構清晰、完整，未形成肝纖維化。模型組大鼠匯管區(qū)域發(fā)生擴張且增生出大量纖維組織，甚至形成纖維間隔。病理檢查結果提示大鼠肝纖維化模型造模成功。見圖1。

圖1 造模結束后空白對照組和模型組大鼠肝組織HE和Masson染色結果（×200）

2.2 各組大鼠血清學指標水平比較與空白對照組比較，模型組IL-1、IL-6、TNF-α、ALT、AST以及Hyp、LN、PIIINP水平明顯升高（P<0.05），ALB水平水平明顯下降（P<0.05）；干預4 w后，低、中、高劑量卡維地洛組大鼠血清ALT、AST、炎癥因子IL-1、IL-6、TNFα水平以及Hyp、LN、PIIINP相比模型組明顯下降（P<0.05），ALB水平明顯上升（P<0.05），且隨著給藥劑量增加，各因子水平改善更顯著。見表1、表2。

表1 各組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α以及ALT、AST、ALB水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α以及ALT、AST、ALB水平比較（±s）

注：與空白對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與低劑量卡維地洛組比較，cP<0.05；與中劑量卡維地洛組比較，dP<0.05。

組別空白對照組模型組低劑量卡維地洛組中劑量卡維地洛組高劑量卡維地洛組例數12 12 12 12 12 IL-1/（pg/mL）16.02±3.36 48.31±5.23a 39.62±4.93ab 32.02±4.25abc 26.18±3.38abcd IL-6/（pg/mL）15.25±4.47 36.38±5.25a 29.62±4.23ab 26.10±3.78abc 20.65±3.62abcd TNF-α/（pg/mL）11.74±3.36 29.25±5.79a 25.20±5.31ab 19.69±4.17abc 16.62±3.27abcd ALT/（U/L）42.32±8.25 158.27±10.08a 102.20±7.16ab 78.29±7.04abc 53.63±5.57abcd AST/（U/L）41.56±7.26 152.31±11.74a 105.78±10.63ab 76.02±9.68abc 63.52±7.31abcd ALB/（g/L）40.45±5.27 24.83±4.72a 28.53±4.83ab 31.85±5.23abc 35.69±5.35abcd

表2 各組大鼠血清Hyp、LN、PIIINP水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清Hyp、LN、PIIINP水平比較（±s）

注：與空白對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與低劑量卡維地洛組比較，cP<0.05；與中劑量卡維地洛組比較，dP<0.05。

組別空白對照組模型組低劑量卡維地洛組中劑量卡維地洛組高劑量卡維地洛組例數12 12 12 12 12 Hyp/（μg/mL）7.10±1.25 17.38±3.24a 14.74±3.13ab 12.02±2.47abc 9.48±2.36abcd LN/（ng/mL）75.25±8.61 136.63±10.96a 105.32±9.47ab 92.18±8.63abc 82.65±6.42abcd PIIINP/（ng/mL）9.44±2.10 26.36±4.23a 20.62±3.56ab 16.63±3.37abc 13.62±2.61abcd

2.3 各組大鼠肝組織病理學檢查結果比較

2.3.1 HE 染色 空白對照組與模型組與驗證模型時HE染色結果顯示的病理變化相似。高劑量卡維地洛組僅出現少量膠原纖維沉積及炎性細胞浸潤，肝索排列整齊，未出現假小葉；中、低劑量卡維地洛組均有不同程度肝細胞變性甚至壞死，浸潤有明顯的炎性細胞以及出現增生的膠原纖維，肝索結構混亂以及出現不同程度的假小葉，其中中劑量卡維地洛組病理程度輕于低劑量卡維地洛組，見圖2。

圖2 干預后各組大鼠肝組織HE 染色結果

2.3.2 Masson 染色 空白對照組與模型組與驗證模型時HE 染色結果顯示的病理變化相似，高劑量卡維地洛組大鼠肝小葉結構完整，少量纖維組織增生；中、低劑量卡維地洛組大鼠存在少量肝小葉結構，以及纖維組織增生。見圖3。

圖3 干預后各組大鼠肝組織Masson染色結果（×200）

2.4 各組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白水平測定結果模型組大鼠TLR4、MyD88 和NF-κB 表達水平相比空白對照組明顯升高（P<0.05）。不同劑量卡維地洛干預后，隨著劑量增加，TLR4、MyD88 和NF-κB 表達水平逐漸降低，表現出明顯的劑量依賴（P<0.05），見表3和圖4。

圖4 各組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平western blot圖

表3 各組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平測定結果（±s）

表3 各組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平測定結果（±s）

注：與空白對照組相比，aP<0.05；表示模型組相比，bP<0.05；與低劑量卡維地洛組比較，cP<0.05；與中劑量卡維地洛組比較，dP<0.05。

組別空白對照組模型組低劑量卡維地洛組中劑量卡維地洛組高劑量卡維地洛組例數12 12 12 12 12 TLR4/β-actin 0.19±0.05 0.45±0.16a 0.38±0.14ab 0.32±0.13abc 0.24±0.08abcd MyD88/β-actin 0.32±0.08 0.96±0.15a 0.85±0.10ab 0.67±0.08abc 0.46±0.07abcd NF-κB/β-actin 0.35±0.06 0.88±0.12a 0.74±0.09ab 0.62±0.06abc 0.51±0.04abcd

2.5 各組大鼠NF-κB 與TLR4/MyD88 mRNA 水平比較模型組大鼠TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表達水平相比空白對照組明顯升高（P<0.05）。不同劑量卡維地洛干預后，隨著劑量增加，TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表達水平逐漸降低，表現出明顯的劑量依賴（P<0.05），見表4。

表4 各組大鼠NF-κB與TLR4/MyD88 mRNA水平比較（±s）

表4 各組大鼠NF-κB與TLR4/MyD88 mRNA水平比較（±s）

注：與空白對照組相比，aP<0.05，與模型組相比，bP<0.05，表示與低劑量卡維地洛組比較，Pc<0.05；與中劑量卡維地洛組比較，dP<0.05。

組別空白對照組模型組低劑量卡維地洛組中劑量卡維地洛組高劑量卡維地洛組例數12 12 12 12 12 TLR4 mRNA 1.00±0.08 3.68±0.21a 2.47±0.17ab 2.10±0.15abc 1.85±0.12abcd MyD88 mRNA 1.00±0.09 3.54±0.18a 2.23±0.12ab 1.97±0.13abc 1.41±0.10abcd NF-κB mRNA 1.12±0.10 3.36±0.18a 2.17±0.16ab 1.75±0.12abc 1.51±0.09abcd

3 討論

TLR4-MyD88-NF-κB 信號通路是參與固有免疫的一種重要信號通路。TLR4屬于肝臟產生炎癥反應的關鍵介質，其在心血管疾病進展過程中發(fā)揮重要作用，但其在肝纖維化進程中的作用機制仍需進一步證實[7]。張斌等[8]研究顯示TLR4 被激活后即將被轉運至細胞內以啟動該信號通路，導致NF-κB 被活化；而NF-κB 作為對多種基因轉錄具有調控作用的重要因子，可參與機體免疫應答、炎癥反應以及細胞凋亡調控等重要生理病理過程并發(fā)揮重要作用。郝健等[9]研究也證實，TLR4可以通過Toll/IL-1受體結構域利用MyD88 依賴或非依賴途徑，進一步活化下游核因子NF-κB，從而促進大量炎癥和細胞因子生成。

卡維地洛屬于第三代β阻滯劑，可以選擇性阻斷α1 受體和非選擇阻斷β 受體，可以發(fā)揮抗氧化和抗增殖作用，且對細胞凋亡具有一定抑制功能[3]。研究報道卡維地洛對交感神經受體具有顯著阻滯作用，從而有效抑制成纖維細胞增殖程度以阻斷細胞外間質合成，發(fā)揮改善心臟間質重塑作用，目前主要應用于心血管疾病的預防和治療[10]。本研究結果表明采用不通過劑量的卡維地洛干預治療后，與模型組比較，高、中、低卡維地洛組隨著其給藥劑量增加，大鼠TLR4、MyD88和NF-κB蛋白和mRNA表達水平降低，表現出明顯的劑量依賴。推測可能是由于卡維地洛通過抑制或阻斷MyD88 依賴途徑，甚至還可能通過阻斷MyD88非依賴途徑進而抑制NF-κB蛋白表達水平。已有研究證實炎性細胞因子在肝纖維化形成中發(fā)揮關鍵作用，肝纖維化和肝硬化患者血清及肝組織中IL-1、IL-6 、TNF-α 等炎性因子表達水平相比正常人均顯著上升[11-12]。本研究表明肝纖維化模型組大鼠的IL-1、IL-6、TNF-α 以及ALT、AST 水平相比空白對照組明顯升高，ALB 水平明顯下降；干預4 w 后，低、中、高劑量卡維地洛組大鼠血清ALT、AST、炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α 水平以及Hyp、LN、PIIINP 水平相比模型組明顯下降，ALB 水平明顯上升，且隨著給藥劑量增加，各因子水平改善更顯著。PIIINP是由III 型前膠原（PCIII）在內肽酶作用下去除C 端球形肽而形成，其可以有效反映PCIII水平，也是目前公認的可以作為反映肝纖維化程度的有效指標[13-14]。本研究通過HE 染色和Masson 染色進一步驗證了卡維地洛對肝纖維化的改善效果，發(fā)現不同劑量卡維地洛組大鼠的膠原纖維沉積以及炎性細胞浸潤均出現不同程度改善，且以高劑量組改善最佳。證實卡維地洛確實可抑制和改善肝纖維化發(fā)生及發(fā)展程度，推測其作用機制可能是卡維地洛通過降低TLR4和NFκB 表達水平進而抑制下游炎性因子分泌，達到降低和改善肝組織炎性細胞浸潤現象，緩解炎癥反應進而改善肝纖維化和肝功能[15-16]。有研究報道卡維地洛可以顯著改善缺氧/復氧誘導心肌H9C2 細胞的凋亡程度，揭示其作用機制也是通過抑制TLR4 /NFκB 信號通路，升高NF-κB 調控蛋白（β-arrestin2）表達水平[17],與本研究的卡維地洛對TLR4 /NF-κB 信號通路具有抑制作用結果一致。

綜上所述，卡維地洛可能通過調控TLR4-MyD88-NF-κB 信號通路調控TLR4、MyD88 以及NFκB蛋白表達，發(fā)揮抑制肝臟炎癥反應和抗纖維作用，從而改善肝纖維化程度。