石露露，韓衛(wèi)南，王 強(qiáng)，許寧寧

（張家口市第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北 張家口 075000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmori?ary disease，COPD）的特征是氣流受限，其與氣道對有害顆粒或氣體的慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，臨床上尚無特效治療方法[1]。氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMC）的過度增殖會引起氣管功能障礙，并參與氣道重塑和氣道高反應(yīng)性[2]。在COPD 患者的支氣管分泌物中檢測到腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）升高，其可以通過TNF 受體（TNF receptor，TNFR）激活核因子（nuclear factor，NF）-κB，上調(diào)靶基因的表達(dá)參與炎性反應(yīng)，如磷脂酶A2 等[3]。近年來研究顯示TNF-α/TNFR/NF-κB 途徑也可以誘導(dǎo)ASMC的過度增殖[4]。燈盞花素是一種從中草藥中分離得到的類黃酮糖苷混合物，其藥理作用包括緩解機(jī)體高凝狀態(tài)、調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)等[5]。已有研究顯示燈盞花素可以緩解COPD病情并調(diào)控患者免疫水平，改善預(yù)后[6]，但是燈盞花素緩解COPD 的機(jī)制以及其對ASMC 的影響仍不明確。本研究主要基于TNF-α/TNFR/NF-κB 途徑探討燈盞花素對COPD 動物模型氣道平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料C57BL/6 小鼠，雄性，4 周齡，湖北省實驗動物研究中心，SCXK(鄂)2015-0018。脂多糖（美國Sigma 公司）。香煙（紅塔集團(tuán)，烤煙型）。燈盞花素注射液（神威藥業(yè)，Z13020778）。小動物肺功能儀（拜安吉）。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）HE試劑盒（碧云天）。RNAspin Mini 試劑盒（美國GE Healthcare）。Bestar qPCR RT 和Bestar?qPCR 試劑盒（德國DBI Bioscience）。Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)（美國Santa）。一抗和山羊抗兔HRP–IgG二抗（ab205718）（美國Abcam）。PVDF膜（中國香港JS0344，JSENB）。ECL 顯色試劑盒（美國Ther?mo Fisher）。 小鼠ASMC 細(xì)胞（美國ATCC 公司）。NF-κB 抑制劑EVP4593（美國Selleck 公司）。5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）試劑（RiboBio）。

1.2 建模將45 只小鼠分為3 組：對照組、COPD 組和COPD+燈盞花素組，每組15 只。通過鼻腔滴入脂多糖(LPS)和香煙環(huán)境誘導(dǎo)建立COPD 模型[7]，在實驗第1周、第5周和第9周的第1天滴入30 μg的LPS，然后將小鼠放置在熏箱中（0.7 m×0.5 m×0.4 m），熏箱中放入點(diǎn)燃香煙，每次10 支，每日1 次，連續(xù)12 w。COPD+燈盞花素組小鼠在建模后使用燈盞花素腹腔注射，每次劑量按燈盞花素計算為48 mg/kg，每日1次，連續(xù)4 w[8]。

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 氣道反應(yīng)性檢測 小鼠通過腹腔注射戊巴比妥鈉（1%，70 mg/kg）麻醉，切開氣管插入導(dǎo)管連接到肺功能檢測儀上，檢測和記錄氣道阻力。

1.3.2 增殖細(xì)胞核抗原檢測（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）小鼠頸脫臼處死后取出肺組織，用4%的聚甲醛固定并用梯度醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為5 μm 的組織玻片標(biāo)本。用Mayer's 蘇木精在室溫下染色10 min，然后用0.5% 的曙紅室溫下染色3 min。將切片在-20°C 的冷丙酮中固定15 min。然后在37°C 下與抗小鼠PCNA 抗體孵育1 h，然后使用IgG 試劑顯色，最后利用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，棕色和黃色染色代表陽性細(xì)胞。

1.3.3 mRNA 檢測 從組織中提取RNA，使用Bestar qPCR RT 試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37 °C /15 min；98 °C /5min。然后使用Bestar?qPCR預(yù)混液進(jìn)行qPCR 實驗，條件如下：95 °C/2 min，94 °C/ 20 s，58 °C 20 s，72 °C/20 s，40 個循環(huán)，最后在72 °C 下 延伸4 min。使 用Agilent Stratagene Mx3000P 序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR 分析。GAPDH 作為內(nèi)源參照，通過比較循環(huán)閾值評估m(xù)RNA水平。

1.3.4 蛋白檢測 將氣管組織研磨后萃取總蛋白并檢測濃度，然后分別取總量為40 μg 的總蛋白進(jìn)行分離，分離條件為10% 的聚丙烯酰胺凝膠、80~120 V、90 min。然后通過濕法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，在100 mV 下將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將一抗稀釋500倍后分別加入膜中并在4 °C 下孵育過夜。洗滌后加入山羊抗兔HRP –IgG 二抗室溫孵育1 h。本研究內(nèi)參為GAPDH，分析目標(biāo)蛋白條帶相對于GAPDH 的灰度值分析蛋白表達(dá)水平。

1.3.5 細(xì)胞增殖檢測 將ASMC分為空白組、模型組、模型+燈盞花素組和模型+燈盞花素+ EVP4593 組。在培養(yǎng)基中加入4% 的香煙提取物和0.1 μg /mL 的脂多糖誘導(dǎo)體外COPD 模型培養(yǎng)24 h[9]，其中培養(yǎng)基中燈盞花素的終濃度為50 mg/L。對于模型+燈盞花素+ EVP4593 組，在培養(yǎng)前加入10 μmol/L 的NF-κB抑制劑EVP4593 預(yù)培養(yǎng)48 h。4 組細(xì)胞用EdU 試劑處理2 h，進(jìn)行染色，細(xì)胞核使用Hoechst 染色。然后在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個高倍視野拍照觀察，計算細(xì)胞增殖比例（=新增殖細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)目×100%）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理所有實驗進(jìn)行3 次平行實驗。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。 統(tǒng)計分析使用SPSS 19 軟件。多組間比較進(jìn)行方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組小鼠氣道阻力比較COPD 組50 mg/mL 和100 mg/mL 條件下的氣道阻力[（9.94±1.67）cm H2O×s/mL，（18.94±2.13）cm H2O×s/mL] 顯 著 高 于 對 照 組[（5.72±0.94）cm H2O×s/mL，（10.15±1.39）cm H2O×s/mL]（P<0.05），COPD+燈盞花素組的氣道阻力[（7.15±1.28）cm H2O×s/mL，（13.78±1.86）cm H2O×s/mL]顯著低于COPD組（P<0.05），見表1。

表1 3組小鼠氣道阻力比較/（cm H2O×s/mL）

2.2 3 組小鼠肺組織和氣管病變比較對照組小鼠肺組織細(xì)胞染色均勻、細(xì)胞形態(tài)正常、排列規(guī)則，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，支氣管壁細(xì)胞排列有序，厚度均勻。COPD 組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管壁明顯增厚。COPD+燈盞花素組肺組織損傷情況和氣管病變情況較COPD組輕。見圖1。

圖1 3組小鼠肺組織和氣管病變比較（×100）

2.3 3組小鼠PCNA 蛋白表達(dá)水平比較COPD 組小鼠ASMC 的PCNA 染色水平顯著升高，COPD+燈盞花素組的PCNA表達(dá)水平低于COPD組。見圖2。

圖2 3組小鼠PCNA蛋白表達(dá)水平比較(×100)

2.4 3 組小鼠TNF-α/TNFR/NF-κB 轉(zhuǎn)錄水平比較3 組小鼠TNF-α、TNFR、NF-κB mRNA 轉(zhuǎn)錄水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 COPD 組的TNF-α、TNFRmRNA、NF-κB mRNA 顯著高于對照組（P<0.05），COPD+燈盞花素組顯著低于COPD 組（P<0.05），見表2。

表2 3組小鼠TNF-α、TNFR、NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

2.5 3組小鼠TNF-α/TNFR/NF-κB蛋白表達(dá)水平比較3 組小鼠TNF-α、TNFR、NF-κB 通路中蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。COPD組的TNF-α、TNFR 、NF-κB 蛋白水平顯著高于對照組（P<0.05），COPD+燈盞花素組顯著低于COPD 組（P<0.05），見表3、圖3。

表3 3組小鼠TNF-α、TNFR、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較

圖3 3組小鼠TNF-α、TNFR、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較

2.6 TNF-α/TNFR/NF-κB 通路對ASMC 增殖的影響4組ASMC 增殖情況比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中模型組的增殖率[（41.26±3.58）%]顯著高于空白組[（15.85±1.87）%]（P<0.05），模型+燈盞花素 組 的 增殖 率[（30.64±3.06）%] 顯 著 低 于 模 型 組（P<0.05），模型+燈盞花素+EVP4593 組的增殖率[（22.18±4.02）%]顯著低于模型+ 燈盞花素組（P<0.05）。見圖4。

圖4 TNF-α/TNFR/NF-κB通路對ASMC增殖的影響（×400）

3 討論

COPD 已成為主要的國際衛(wèi)生問題，其患病率和死亡率日漸增多[10]。 COPD 最常見的癥狀為長期咳嗽、咳痰、呼吸急促和呼吸困難。氣道上皮細(xì)胞增殖會引起氣管壁增厚、氣道重塑和高反應(yīng)性，是COPD的主要發(fā)病機(jī)制之一[11]。燈盞花素（C42H36O23）是從燈盞花中提取的一種黃酮類化合物，其具有擴(kuò)張毛細(xì)血管、減少血小板凝集、清除自由基和改善微循環(huán)的作用[12]。臨床研究已經(jīng)顯示了燈盞花素可緩解急性COPD，并改善患者肺功能提高預(yù)后[13]。本研究利用LPS 和香煙構(gòu)建了COPD 小鼠模型，并通過燈盞花素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示燈盞花素可以明顯的減少COPD模型小鼠阻力，緩解氣管壁增厚，并且可以顯著的抑制ASMC 的增殖?，F(xiàn)階段燈盞花素抑制細(xì)胞增殖的作用主要集中在腫瘤細(xì)胞中，研究顯示燈盞花素具有抑制肝癌[14]和前列腺癌[15]的腫瘤細(xì)胞增殖的作用。此外，體外研究也證實了燈盞花素可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖[16]。本研究結(jié)果提示燈盞花素緩解COPD的作用可能與抑制細(xì)胞增殖有關(guān)，可能通過抑制ASMC 的增殖緩解氣道高反應(yīng)，從而抑制氣道重塑，進(jìn)而緩解COPD。

為進(jìn)一步分析燈盞花素抑制ASMC 增殖的機(jī)制，本研究檢測了TNF-α/TNFR/NF-κB 通路表達(dá)水平。該通路在COPD 中發(fā)揮重要作用，一方面，是因為激活NF-κB 蛋白的轉(zhuǎn)錄功能，促進(jìn)促炎因子的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致炎性反應(yīng)[17]；另一方面，TNF-α 也可以通過NF-κB通路促進(jìn)ASMC 的增殖[18]。本研究發(fā)現(xiàn)燈盞花素可以明顯的抑制COPD 模型小鼠TNF-α/TNFR/NF-κB通路的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。已有研究結(jié)果表明燈盞花素抑制了ASMC 的增殖，并且EVP4593 抑制TNF-α/TNFR/NF-κB 通路后會進(jìn)一步提高燈盞花素的抗增殖作用[19]。燈盞花素可通過抑制NF-κB 通路緩解腦損傷[20]。燈盞花素通過抑制LPS 誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB 途徑來抑制神經(jīng)炎癥[21]。燈盞花素可通過抑制TNF-α表達(dá)和NF-κB的活化抑制滑膜細(xì)胞的增殖并抑制炎性反應(yīng)[23]。以上文獻(xiàn)研究結(jié)果提示燈盞花素具有抑制TNF-α/TNFR/NF-κB 通路的功效，而本研究結(jié)果則表明燈盞花素可能通過抑制TNF-α/TNFR/NF-κB 通路的轉(zhuǎn)錄和翻譯，來抑制炎性反應(yīng)和抑制ASMC 增殖，從而發(fā)揮抗COPD 的作用。

綜上所述，燈盞花素可能通過抑制TNF-α/TN?FR/NF-κB 通路抑制ASMC 的增殖，進(jìn)而減少氣道阻力。關(guān)于燈盞花素調(diào)控TNF-α/TNFR/NF-κB 通路的機(jī)制得深入研究，這可能成為治療COPD的新方法。