劉 寧，馬洪芳，楊文浩

（開灤總醫(yī)院1腫瘤科，2外科，3風(fēng)濕免疫科，河北 唐山 063000）

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，且易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，5 年生存率不佳[1]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞在特定生理、病理情況下轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的現(xiàn)象，被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲的起始步驟，與惡性腫瘤進程密切相關(guān)[2]。近年來多項研究顯示，微小RNA（microRNA，miR）參與調(diào)控多種惡性腫瘤細胞如結(jié)腸癌的增殖、侵襲及遷移等過程[3-5]。miR-195在前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌的腫瘤組織或細胞系中表達異常降低，通常作為抑癌基因發(fā)揮作用[6-8]。本研究通過體外細胞實驗，研究miR-195對結(jié)直腸癌細胞EMT 及侵襲的影響，并探討相關(guān)機制，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料正常腸上皮細胞系NCM460、結(jié)直腸癌細胞系HCT116，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。miR-195 mimic、NC mimic，由弗元（上海）生物科技有限公司構(gòu)建。Toll 樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子κB（toll like receptor 4/nuclear transcription factor κB，TLR4/NFκB）信號 通路 激活 劑 脂多 糖（lipopolysaccharide，LPS），上海研謹生物科技有限公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）試劑盒，上海信裕生物科技有限公司。兔抗人波形蛋白（Vimentin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、TLR4、髓樣細胞分化因子88（my?eloid differentiation factor 88，MyD88）、p50、p65 一抗，購自美國Abcam公司。

Transwell 小室，購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司。紫外分光光度計，上海譜元儀器有限公司。TURE script One Step qRT-PCR 儀，購自北京百奧萊博科技有限公司。CheniDoc Touch 成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) NCM460、HCT116 細胞分別培養(yǎng)于1640 培養(yǎng)基、DEME 培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中補充100 mg/L 鏈霉素、100 U/mL 青霉素、10% 胎牛血清，標準條件（5% CO2、37 ℃、飽和濕度）。觀察到細胞融合度>80% 左右時，0.25% 胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 qRT-PCR 檢測 miR-195 表達量取對數(shù)期NCM460、HCT116 細胞，Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度計測定濃度、純度后逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，定量后按照試劑盒說明書要求設(shè)定反應(yīng)體系：總體積20.0 μL，SYBR Premix Ex Taq II 11.5 μL，上、下游引物（10.0 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板1.5 μL，加入DD H2O 補足20.0 μL；90 ℃預(yù)變性6 min；95 ℃變性15 s，64 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)42個循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，2-△△CT為目的基因相對表達強度，實驗所用引物：miR-195：Forward primer：5'-TGCATGTC?GTGTGCACGTTGCACG-3'；Reverse primer：5'-CTC?GTGCACGCCATGTGCGTGTGC-3'；U6 snRNA：For?ward primer：5'-AGCTTGTAAGCGTGTGTGCAACAC-3'；Reverse primer：5'-GTGACGTCACACGGCCGTG?CACAC-3'。實驗重復(fù)3次取均值。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期HCT116細胞，接種至6孔板（1×105個/mL），當細胞再次融合達70% 左右時，隨機分 為Control 組、NC 組、miR-195 mimic 組、miR-195 mimic＋LPS 組，Control 組不作處理，miR-195 mimic 組、NC 組按照LipofactamineTM2000 試劑盒說明書轉(zhuǎn)染miR-195 mimic、NC mimic，miR-195 mimic＋LPS 組轉(zhuǎn)染miR-195 mimic，并加入LPS 使其濃度為100 μg/mL。每組設(shè)置5 個復(fù)孔，培養(yǎng)至48 h 用于后續(xù)實驗。

1.2.4 qRT-PCR 檢測 miR-195 表達量取各組培養(yǎng)至48 h的細胞，同1.2.2項提取總RNA、獲取cDNA、設(shè)定反應(yīng)體系、設(shè)定反應(yīng)條件、設(shè)計引物序列。以U6為內(nèi)參基因，2-△△CT為目的基因相對表達強度計算miR-195表達量。實驗重復(fù)3次取均值。

1.2.5 Transwell 實驗觀察侵襲能力 取Transwell 杯狀小室，杯底濾膜預(yù)先均勻涂布Matrigel 膠（1:6 稀釋），放置在24 孔板中。上層小室中加入各組細胞懸液200 μL（密度2.0×105個/mL），下層小室中加入RPMI 1640 培養(yǎng)基0.6 mL（含10% 胎牛血清）。培養(yǎng)24 h 至Matrigel 膠被降解。取出小室，PBS 沖洗，0.25 %戊二醛固定15 min，0.1% 結(jié)晶紫避光染色30 min，無菌棉簽擦去上層小室細胞，洗滌、晾干。顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)量，隨機選取10個視野，計算每個視野平均數(shù)。實驗重復(fù)3次取均值。

1.2.6 劃痕試驗觀察遷移能力 取各組培養(yǎng)至48 h的細胞。胰蛋白酶消化，重懸，調(diào)整密度至1×104個/mL，接種至6 孔板，孵育過夜，細胞再次融合，棄去培養(yǎng)基；在培養(yǎng)板底部用20 μL 移液器槍頭劃痕，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡拍照，計算遷移率。遷移率（%）=（初始劃痕寬度－24 h 后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.2.7 Western blot 法檢測細胞Vimentin、E-cadherin蛋白表達量 取各組培養(yǎng)至48 h 的細胞，預(yù)冷RIPA細胞裂解液冰上裂解，離心后提取全蛋白，經(jīng)二喹啉甲酸試劑盒定量。取30 μg 待測樣本，恒壓下經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至膜，封閉液室溫封閉2 h，洗滌，加入1:500稀釋的兔抗人Vi?mentin、E-cadherin 一抗，4 ℃孵育過夜，加入1:2 000稀釋的山羊抗兔IgG 二抗，常溫孵育2 h，洗滌。加入發(fā)光液，暗室中顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，目的蛋白相對表達量以條帶/GAPDH 條帶灰度值表示。實驗重復(fù)3次取均值。

1.2.8 雙熒光素酶實驗驗證miR-195 與TLR4 的靶向關(guān)系 采用生物信息學(xué)軟件miRanda、TargetScan初步預(yù)測，含有miR-195 結(jié)合位點的TLR4 mRNA 3'UTR，由上海位點生物科技有限公司對其進行鑒定與擴增。采用T4 DNA 連接酶將TLR4 mRNA 3'UTR 與線性化改良的雙熒光素酶報告載體（pmir-RB-RE?PORTTM）相連，構(gòu)建TLR4 雙熒光素酶報告載體，命名為pmir-RB-REPORTTM-TLR4-3'-UTR。 將pmir-RB-REPORTTM、 pmir-RB-REPORTTM-TLR4-3'-UTR、miRNA-195質(zhì)粒（miR-195 mimic、NC mimic）共轉(zhuǎn)染至293T 細胞，形成6 個轉(zhuǎn)染組：pmir-RB-RE?PORTTM組、pmir-RB-REPORTTM＋NC mimic 組、pmir-RB-REPORTTM＋miR-195 mimic 組、pmir-RB-RE?PORTTM-TLR4-3'-UTR 組、pmir-RB-REPORTTMTLR4-3'-UTR＋NC mimic 組、pmir-RB-REPORTTMTLR4-3'-UTR＋miR-195 mimic組。孵育48 h后PBS清洗，裂解20 min 后檢測熒光素酶強度，按照熒光素酶試劑盒說明書要求進行操作，并計算相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.9 Western blot 法檢測細胞TLR4、MyD88、NFκB p65、p-NF-κB p65 蛋白表達量 取各組培養(yǎng)至48 h 的細胞，采用細胞核與細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒分別提取細胞核與細胞質(zhì)蛋白，BCA 試劑盒定量。分別取30 μg 細胞核蛋白、細胞質(zhì)蛋白，細胞核蛋白檢測p50、p65 蛋白表達量，細胞質(zhì)蛋白檢測TLR4、MyD88蛋白表達量。恒壓下經(jīng)12% SDS 聚丙烯酰氨凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至膜，封閉液室溫封閉2 h，洗滌，加入稀釋度為1:500 的兔抗人TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NFκB p65 一抗，4℃搖床孵育過夜，洗滌，加入稀釋度為1:2 000 山羊抗兔二抗，常溫孵育2 h，洗滌。加入發(fā)光液，暗室中顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，目的蛋白相對表達量以條帶/GAPDH 條帶灰度值表示。實驗重復(fù)3次取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用IBM SPSS 21.0 軟件處理、分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本計量資料采用單因素方差分析，以LSD-t檢驗分析兩兩樣本。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細胞系中miR-195 表達量比較正常腸上皮細胞系NCM460、結(jié)直腸癌細胞系HCT116 中miR-195 表 達 量 分 別 為（0.85±0.09）、（0.26±0.03），與NCM460 細胞系比較，HCT116 系中miR-195 表達量顯著降低（P<0.05）。見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測NCM460、HCT116細胞系中miR-195和內(nèi)參U6的擴增曲線

2.2 各組miR-195 表達量比較Control 組、NC 組、miR-195 mimic 組、miR-195 mimic＋LPS 組miR-195表 達 量 分 別 為（0.27±0.04）、（0.26±0.05）、（1.36±0.21）、（0.92±0.10），與Control 組、NC 組比較，miR-195 mimic 組miR-195 表達量顯著升高，與miR-195 mimic 組比較，miR-195 mimic＋LPS 組miR-195 表達量顯著降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測4組細胞中miR-195、內(nèi)參U6的擴增曲線

2.3 各組侵襲能力比較 Control 組、NC 組、miR-195 mimic 組、miR-195 mimic＋LPS 組每個視野平均穿膜細胞數(shù)量分別為（125.40±17.33）、（123.60±18.92）、（32.00±7.61）、（68.40±10.92）個，與Control 組、NC 組比較，miR-195 mimic 組每個視野平均穿膜細胞數(shù)量顯著減少（P<0.05）；與miR-195 mimic 組比較，miR-195 mimic＋LPS 組每個視野平均穿膜細胞數(shù)量顯著增加（P<0.05）。見圖3。

圖3 miR-195 mimic轉(zhuǎn)染后各組穿膜細胞數(shù)比較（×200，標尺50 μm）

2.4 各組遷移能力比較Control 組、NC 組、miR-195 mimic 組、miR-195 mimic＋LPS 組細胞遷移率分別為（75.21±8.33）% 、（76.30±8.19）% 、（45.23±6.70）% 、（59.25±6.81）%，與Control 組、NC 組比較，miR-195 mimic 組遷移率顯著降低（P<0.05）；與miR-195 mim?ic 組比較，miR-195 mimic＋LPS 組遷移率顯著升高（P<0.05）。見圖4。

圖4 miR-195 mimic轉(zhuǎn)染后各組遷移率比較（×100，標尺25 μm）

2.5 各組細胞Vimentin、E-cadherin 蛋白表達量比較與Control 組、NC 組比較，miR-195 mimic 組Vi?mentin 蛋白表達量顯著降低（P<0.05），E-cadherin 蛋白表達量顯著升高（P<0.05）；與miR-195 mimic 組比較，miR-195 mimic＋LPS 組Vimentin 蛋白表達量顯著升高（P<0.05），E-cadherin 蛋白表達量顯著降低（P<0.05）；Control 組、NC 組Vimentin、E-cadherin蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1 和圖5。

圖5 各組細胞Vimentin、E-cadherin蛋白表達量

表1 各組細胞Vimentin、E-cadherin蛋白表達量比較（-x±s，n=5）

2.6 雙熒光素酶實驗結(jié)果雙熒光素酶結(jié)果顯示，與僅轉(zhuǎn)染pmir-RB-REPORTTM的293T 細胞比較，共轉(zhuǎn)染pmir-RB-REPORTTM-TLR4-3'-UTR 與miR-195 mimic 的293T 細胞熒光素酶活性值顯著升高（P<0.05）?？芍猅LR4 是miR-195 的一個靶基因，兩者結(jié)合位點為TLR4 的3'-UTR 片段（結(jié)合位點為HasmiR-195 序 列3'-AUCGGACGUGUACGCACGCGA?CUC-5' 中CGCGACUC 與TLR4 3'-UTR 序 列5'-ACUGCACGCCAAACGCCGCGCUGAG-3' 中 GC?GCUGAG）。見圖6。

圖6 雙熒光素酶實驗結(jié)果

2.7 TLR4、MyD88 蛋白表達 量、p-NF- κB p65/NF-κB p65 比較與Control 組、NC 組比較，miR-195 mimic 組TLR4、MyD88 蛋 白 表 達 量、p-NF- κB p65/NF-κB p65 顯著降低（P<0.05）；與miR-195 mim?ic組比較，miR-195 mimic＋LPS組TLR4、MyD88蛋白表 達 量、p-NF- κB p65/NF- κB p65 顯 著 升 高（P<0.05）；Control 組、NC 組TLR4、MyD88 蛋白表達量、p-NF-κB p65/NF-κB p65 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖7。

圖7 miR-195 mimic轉(zhuǎn)染后各組TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達比較

3 討論

結(jié)直腸癌是起源自腸上皮組織的惡性腫瘤，研究認為家族史、高脂飲食、低纖維飲食、高血壓史、糖尿病史等均是其發(fā)生的風(fēng)險因素[9]。目前手術(shù)切除及放化療等是臨床干預(yù)結(jié)腸癌的常用方式，但因患者在確診時已進入中晚期，干預(yù)效果并不理想。研究顯示，腫瘤轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者的主要死因，15%~25% 的患者在確診前已發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，且>50% 的患者發(fā)生浸潤及轉(zhuǎn)移[10]。EMT是腫瘤細胞的重要特征，其異常激活將導(dǎo)致惡性腫瘤形成及發(fā)展。因此，抑制EMT 過程對于改善結(jié)腸癌預(yù)后至關(guān)重要。隨著基礎(chǔ)研究的逐漸深入，基因治療為結(jié)腸癌治療提供了新的希望。

在腫瘤生長、發(fā)展的過程中，EMT 主要包括細胞極性變化、細胞間喪失黏附、細胞外基質(zhì)與腫瘤基底膜被破壞，進而獲取高侵襲、遷移能力，表現(xiàn)為間質(zhì)細胞標志物如Vimentin表達增加，上皮細胞標志物如E-cadherin 表達降低[11]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌細胞系HCT116 中miR-195 表達量顯著低于正常腸上皮細胞系NCM460；通過轉(zhuǎn)染方式上調(diào)HCT116 中miR-195 表達量后，每個視野平均穿膜細胞數(shù)量減少、遷移率降低，Vimentin 蛋白表達量降低，E-cad?herin 蛋白表達量升高，提示miR-195 在結(jié)腸癌細胞中低表達，且上調(diào)其表達可抑制結(jié)腸癌細胞EMT 及侵襲。miRNA 是調(diào)節(jié)基因表達的重要因子，且其表達模式與腫瘤起源關(guān)系密切，而且可能參與腫瘤分化[12]。miR-195 位于染色體17p13.1 上，該部位在腫瘤發(fā)展過程中易缺失，在腫瘤研究中其被認為是抑癌基因[13]。Song 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-195 水平與胃癌癌癥標志物水平呈負相關(guān)，且在診斷及預(yù)測其化療效果上具有重要價值。施能等[15]采用miR-195 模擬物轉(zhuǎn)染舌鱗癌CAL27 細胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-195 的過表達可顯著抑制細胞活力，低表達則表現(xiàn)出相反效果，與本研究結(jié)果均提示過表達miR-195具有顯著的抗癌細胞作用。

TLR4是一種重要的固有免疫分子及跨膜模式識別受體，其可識別包括LPS 在內(nèi)的外源性配體，并通過在慢性炎癥反應(yīng)過程中創(chuàng)造腫瘤微環(huán)境，參與調(diào)控腫瘤發(fā)生與發(fā)展。TLR4識別外源性配體或內(nèi)源分子后，將識別信號傳遞給MyD88，誘導(dǎo)NF-κB 轉(zhuǎn)入細胞核并發(fā)生磷酸化，從而激活下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄過程，激活巨噬細胞、單核細胞等合成及分泌白介素-6（IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥介質(zhì)，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)[16]。研究指出，通過減輕炎癥反應(yīng)，抑制TLR4/NF-κB 信號傳導(dǎo)，可有效降低癌癥標志物水平，抑制DNA 損傷及癌癥干細胞的增殖、去分化，提示該通路在結(jié)直腸癌中的作用[17]。本研究采用雙熒光素酶實驗驗證miR-195 與TLR4 的靶向關(guān)系，結(jié)果表明兩者存在靶向關(guān)系；與Control 組、NC組比較，miR-195 mimic組TLR4、MyD88蛋白表達量、p-NF-κB p65/NF-κB p65 顯著降低，且增用TLR4/NF-κB信號通路激活劑LPS后，過表達miR-195對結(jié)直腸癌細胞EMT 及侵襲的抑制作用有所減弱，提示miR-195 可能通過靶向抑制TLR4/NF-κB 信號通路，發(fā)揮對結(jié)直腸癌細胞的作用。

綜上所述，過表達miR-195 可通過靶向抑制TLR4/NF-κB 信號通路，發(fā)揮對結(jié)直腸癌細胞EMT 及侵襲的抑制作用。關(guān)于miR-195 是否存在其他作用靶點，仍有待深入研究。