劉乙璇，龔澤華，馮思國(guó)，李建民，王婧瑤，劉俊杰

（華北理工大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院；2附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000）

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是一類臨床上常見(jiàn)且致死致殘率極高的神經(jīng)外科疾病[1]。研究表明在SAH 發(fā)病過(guò)程中起主要作用的是早期腦損傷（early brain injury, EBI），表現(xiàn)為患者腦組織水腫、腦血管痙攣和血－腦脊液屏障受損等病理生理改變[2]。尋找切實(shí)有效的治療藥物及調(diào)控靶點(diǎn)是目前研究重點(diǎn)。YUAN 等研究發(fā)現(xiàn)SAH 后血腦屏障的破壞與腦損傷的發(fā)展和不良的臨床結(jié)果密切相關(guān)[3]。近年研究表明頭孢曲松（ceftriaxone，CEF）這一β-內(nèi)酰胺類的抗生素對(duì)于腦損傷也具有一定的保護(hù)作用[4]，但其機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠SAH 模型，研究CEF 對(duì)SAH 后血腦屏障通透性、腦組織含水量及皮質(zhì)細(xì)胞凋亡等方面的影響，從而為臨床SAH的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥頭孢曲松(齊魯制藥有限公司，批號(hào)：0080418)；兔抗Caspase-3 多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司，批號(hào)：SC-7148）、兔抗MMP-9 多克隆抗體以及相應(yīng)二抗（美國(guó)Santa Cruz 公司，批號(hào)：SC-21733）；化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Solarbio 公司，批號(hào)：SW2020）；TUNEL 試 劑 盒( 瑞 士Roche 公 司，批 號(hào)20200614)；820-Ⅱ型切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；TP-1型攤片機(jī)（天津天利機(jī)電公司）；Motic-6.0 圖像采集及分析系統(tǒng)（日本OLYMPUS 公司）；攝影生物光學(xué)顯微鏡（日本NIKON 公司）；低溫離心機(jī)（上海金壇市醫(yī)療儀器廠）；酶標(biāo)儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）；電泳儀、電轉(zhuǎn)槽、化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48 只健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（270±10）g，購(gòu)自北京維通利華，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：2019-002。

1.3 模型制備用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉SD 大鼠，仰臥位固定，頸正中做切口，依次分離頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，離斷頸外動(dòng)脈，從頸外動(dòng)脈近心殘端刺入4-0 銳化手術(shù)縫合線，插入18～20 mm后到達(dá)大鼠大腦前動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈交界處，感受到一定阻力后穿破血管壁，再刺入3 mm 制成SAH 手術(shù)模型。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行同樣的手術(shù)操作，但不刺破血管。操作結(jié)束后立即拉出穿刺線，恢復(fù)正常的血液灌注，使用呼吸機(jī)維持大鼠呼吸，直到大鼠能夠正常呼吸。術(shù)后72 h 后取材，SAH 手術(shù)模型制作成功的表現(xiàn)為蛛網(wǎng)膜下腔出現(xiàn)血凝塊；若不合格則剔除實(shí)驗(yàn)。

1.4 分組與給藥將建模成功的48只大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（Sham組）、SAH模型組和頭孢曲松低、高劑量組（分別給予CEF，50、200 mg/kg）。頭孢曲松低、高劑量組大鼠在術(shù)后0.5、24 和48 h，分別腹腔注射給予CEF 50 和200 mg/kg 體質(zhì)量，假手術(shù)組及SAH模型組大鼠腹腔注射生理鹽水0.5 mL。

1.5 指標(biāo)的測(cè)定

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)分[5]根據(jù)Garcia 評(píng)分系統(tǒng)，評(píng)估SAH 后神經(jīng)功能損傷程度。得分越高，相對(duì)應(yīng)的大鼠神經(jīng)損傷程度越輕。測(cè)試項(xiàng)目包括自主運(yùn)動(dòng)檢測(cè)、四肢活動(dòng)檢測(cè)、前爪運(yùn)動(dòng)及力量、身體的本體感覺(jué)、攀爬實(shí)驗(yàn)、和觸覺(jué)試驗(yàn)檢測(cè)。前3項(xiàng)各項(xiàng)得分0～3，后3 項(xiàng)各項(xiàng)得分1～3。6 項(xiàng)測(cè)試所得分?jǐn)?shù)相加即為評(píng)分。評(píng)分分為3個(gè)等級(jí)：1～6分為神經(jīng)功能重度損傷，7～12 分為神經(jīng)功能中度損傷，13～18 分為神經(jīng)功能輕度損傷。

1.5.2 腦組織含水量測(cè)定 造模72 h后處死大鼠，腦組織立即被分成左右大腦半球、腦干和小腦。稱濕重后腦標(biāo)本放進(jìn)烤箱中于105 ℃的環(huán)境干燥72 h，再稱腦組織干重。干濕重法測(cè)量腦組織含水量: 腦含水量（%）＝（腦組織濕重－腦組織干重）／腦組織濕重×100%。

1.5.3 腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞的檢測(cè) 72 h 后取病灶側(cè)腦組織，用多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。根據(jù)試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行TUNEL 染色。切片行常規(guī)預(yù)處理，使用過(guò)氧化氫室溫封閉10 min；PBS洗滌，隨后滴加平衡緩沖液，風(fēng)干多余液體立即滴加工作強(qiáng)度轉(zhuǎn)移酶充分覆蓋組織，并置于濕盒中溫箱孵育1 h，使用洗滌液停止反應(yīng)；最后滴加抗地高辛氧化酶經(jīng)室溫孵育30 min 后熒光染色。鏡下觀察并攝片，每張切片在海馬CA1 區(qū)隨機(jī)選取5 個(gè)視野，進(jìn)行TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，即為凋亡細(xì)胞數(shù)量。

1.5.4 腦組織中Caspase?3和MMP?9蛋白的測(cè)定取大鼠血凝塊周圍腦組織，加入裂解液（腦組織體積∶裂解液=1∶4）置于勻漿機(jī)內(nèi)充分研磨后，于4 ℃下12 000 r/min離心20 min提取蛋白。使用BCA 法定量海馬蛋白含量，配制上樣緩沖液，行電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。封閉液封閉膜，兔抗大鼠的Caspase-3、MMP9（1∶1 000）多克隆抗體4 ℃孵育12 h，1∶2 000 的二抗在常溫下孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)條帶。用Image J 軟件進(jìn)行密度測(cè)定，定量分析Blot 條帶。β-肌動(dòng)蛋白（1∶2 000；Santa Cruz）作為內(nèi)參對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較與Sham 組比較，SAH 組的Garcia 評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與SAH 組比較，SAH＋CEF 低、高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與SAH＋CEF 低劑量組比較，SAH＋CEF 高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分（-x±s，n=12）

2.2 各組大鼠腦組織含水量的比較與Sham 組比較，SAH 組大鼠腦組織的水含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與SAH 組比較，SAH＋CEF 低、高劑量組腦組織水含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與SAH＋CEF 低劑量組比較，SAH＋CEF 高劑量組腦組織水含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織含水量的比較（-x±s，n=6，%）

2.3 各組大鼠腦組織TUNEL 染色結(jié)果與Sham 組比較，SAH 組TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與SAH 組比較，SAH＋CEF 低、高劑量組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與SAH＋CEF 低劑量組比較，SAH＋CEF 高劑量組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1，表3。

表3 各組大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)的比較（-x±s，n=6）

圖1 各組大鼠Tunel染色圖

2.4 CEF 對(duì)各組大鼠Caspase-3、MMP-9 蛋白表達(dá)的影響與Sham 組比較，SAH 組病灶處腦組織MMP-9和Caspase-3蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與SAH 組比較，SAH＋CEF 低、高劑量組MMP-9和Caspase-3蛋白的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與SAH＋CEF 低劑量組比較，SAH＋CEF 高劑量組MMP-9 和Caspase-3 蛋白的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,見(jiàn)圖2，表4。

圖2 各組大鼠出血區(qū)MMP-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)

表4 各組大鼠出血區(qū)腦組織MMP-9、Caspase-3蛋白表達(dá)量比較（-x±s，n=6）

3 討論

目前研究認(rèn)為早期腦損傷是影響SAH 預(yù)后的主要因素，包括腦水腫、血腦屏障破壞等。其中腦水腫被證實(shí)為SAH 后死亡和不良預(yù)后的主要危險(xiǎn)因素[6]。同時(shí)有研究表明，SAH 后腦水腫主要是血管源性的，即血腦屏障功能障礙所致[7]。因此SAH 后血腦屏障的破壞與腦損傷的發(fā)展和不良的臨床結(jié)果密切相關(guān)[8]。但其機(jī)制未明且缺乏干預(yù)措施。本研究發(fā)現(xiàn)CEF 治療后，腦水腫程度明顯減輕，且高劑量效果更為顯著?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase ,MMPs）可由多種細(xì)胞生成，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等。 MMP-9 被認(rèn)為是功能最大的MMP，可降解腦基底膜，且在維持血管完整性中腦基底膜起到主要作用[9]。Gregory 等[10]研究發(fā)現(xiàn)MMP-9可水解血腦屏障緊密連接的主要成分Ⅳ型膠原，從而破壞血腦屏障。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接以及基底膜的完整是血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的保障。SAH后，早期即有MMP-9蛋白表達(dá)量明顯升高，破壞血腦屏障的完整性而導(dǎo)致血管源性腦水腫的發(fā)生[11-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEF 治療后SAH 腦組織中MMP-9的表達(dá)量明顯的減少，且高劑量組更為顯著。提示降低MMP-9 的表達(dá)可能是CEF 減輕SAH 大鼠腦水腫的重要機(jī)制。

大量研究發(fā)現(xiàn)，CEF在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中比如腦外傷、腦卒中等均具有神經(jīng)保護(hù)作用[14-16]。張帆等[17]研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，過(guò)量的谷氨酸所造成的神經(jīng)興奮性毒性可損害神經(jīng)元細(xì)胞，影響神經(jīng)功能，而CEF 可提高興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（EAAT）的表達(dá)，維持細(xì)胞外谷氨酸濃度在正常水平，并清除神經(jīng)傳遞過(guò)程中釋放的谷氨酸鹽[18]。Xhi?ma 等[19]研究表明，谷氨酸的興奮性毒性可破壞血腦屏障的完整性，使血腦屏障的通透性增加。SAH 誘導(dǎo)嚴(yán)重的谷氨酸興奮性毒性，腦脊液中谷氨酸濃度迅速增加，血腦屏障也受到嚴(yán)重破壞，從而導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生。陳旭等[20]研究發(fā)現(xiàn)作為FDA 批準(zhǔn)的β-內(nèi)酰胺類抗生素，CEF 增加EAAT 基因的轉(zhuǎn)錄并增強(qiáng)EAAT 的表達(dá)，從而使谷氨酸的興奮性毒性降低，起到神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEF治療后SAH大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯提高，且呈劑量依賴型。提示CEF 治療對(duì)SAH 大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示CEF 治療可能通過(guò)提高EAAT 的表達(dá)降低谷氨酸的興奮性毒性，從而改善血腦屏障功能，減輕腦水腫。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，CEF治療后凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，凋亡因子Caspase-3 的表達(dá)也相應(yīng)減少，且呈劑量依賴性，高劑量CEF 治療，神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減少。提示CEF 治療可減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減少神經(jīng)細(xì)胞的丟失，從而改善神經(jīng)功能。綜上所述，CEF可能通過(guò)降低谷氨酸的興奮性毒性，抑制MMP-9 蛋白表達(dá)，改善血腦屏障的功能，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡來(lái)緩解SAH 后早期腦損傷。本研究結(jié)果可能為CEF 臨床用于SAH 的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。