韓會靖，施興海，孫麗華

（1新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院，烏魯木齊，830011；2新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市第一人民醫(yī)院實驗室，烏魯木齊 830002；3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病中心，烏魯木齊 830054）

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見的惡性腫瘤。在腫瘤致死原因中居第四位，2018 年全球約有841000例新病例，每年有78.2 萬人死亡[1]。全球47.1% 的死亡病例在中國。2015 年我國肝癌所死亡率為25.26／10萬，位居全部惡性腫瘤第二位[2]，肝細(xì)胞癌（hepa?tocellular carcinoma，HCC）是成人中最常見的原發(fā)性腫瘤，是全球癌癥死亡的主要原因。肝內(nèi)擴散和肝外轉(zhuǎn)移是肝癌惡性生長的關(guān)鍵因素。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為原發(fā)性 肝癌 屬“肝 積”“臌 脹”“癖 黃”“癥 瘕”“肝 壅”“黃疸”等范疇[3]，治療原則以驅(qū)邪扶正為主。艾迪注射液是臨床常見的藥物類型，具有化瘀散結(jié)、清熱解毒的功效，主要包括刺五加、人參、斑螯、黃芪等，是一種新型的復(fù)方中藥注射液[4-5]。有研究顯示，艾迪注射液可以通過多成分、多靶點治療肝細(xì)胞癌[6]。CD34是內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，主要表達于肝血竇的毛細(xì)血管，其顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性最高[7-8]，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），主要表達于肝臟腫瘤及肝纖維化中新生的血管。為了探討艾迪注射液對肝癌血管內(nèi)皮的影響，本研究以CD34 和α-SMA 為研究對象，研究艾迪注射液干預(yù)下CD34和α-SMA的表達，探討艾迪注射液的抗癌作用機制，為天然植物應(yīng)用于肝癌臨床治療提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康Wistar 大鼠30 只，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，清潔級，雄性，體重（200±20）g。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2018-0001；動物使用許可證號：SYXK(新)2018-0003。本實驗獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過，倫理審批號：IACUC20180313-04。所有大鼠在20～25°C下保持12 h的明暗循環(huán)，自由攝食和飲水。

1.2 主要儀器與試劑二乙基亞硝胺(DEN )購自Sig?ma 公司，艾迪注射液（貴州益佰制藥股份有限公司，規(guī)格10 mL/支，批號：國藥準(zhǔn)字Z52020236）。兔抗α–SMA（ab108424），CD34（ab81289）由英國ABCAM公司生產(chǎn)，通用型二抗由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，Masson 試劑盒（MXB 邁新試劑）。常用眼科手術(shù)器械，電子秤（上海鷹牌衡器有限公司）。天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，深圳邁瑞半自動生化分析儀。

1.3 實驗動物分組及造模30 只大鼠分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w 后隨機分為對照組、模型組、艾迪注射液處理組，每組10 只。對照組按0.1 mL/kg 的劑量腹腔注射生理鹽水，每周注射1 次，共注射20 w。模型組大鼠給予一次性腹腔注射100 mg/kg 體重的DEN，后給予0.05%DEN 自由飲水。艾迪注射液處理組大鼠開始腹腔注射DEN 時即給予艾迪注射液1 mL/kg，后每周注射1 次，共注射20 w，末次給藥后24 h，應(yīng)用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采用腹主動脈采血，4°C，3 000 r/min離心5 min，分離血清，采用生化分析儀測定血清中ALT、AST、ALP含量，對大鼠行安樂死后，取各組大鼠肝臟組織。

1.4 病理學(xué)檢查肝臟標(biāo)本取材固定于100 mL/L 的中性福爾馬林，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm 切片，分別做HE 染色和Masson 染色（按試劑盒說明書步驟操作）。顯微鏡下觀察大鼠肝組織病理學(xué)情況，觀察肝臟炎癥的壞死程度及肝包膜、匯管區(qū)、肝竇及中央靜脈等處膠原纖維增生情況。

1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測肝組織中α-SMA 抗體和CD34蛋白的表達肝組織石蠟包埋后，切成4 μm切片。經(jīng)脫蠟脫水后孵育一抗α-SMA 抗體（1:200）和CD34 抗體（1:1000），4℃過夜，二抗37℃孵育2 h。經(jīng)DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，將各組切片隨機選取10個視野。測定每個視野中陽性細(xì)胞所占百分比。α-SMA 表達判斷標(biāo)準(zhǔn)：以肝血管內(nèi)出現(xiàn)棕色、棕黃色染色為陽性細(xì)胞，每張切片分別隨機選取5個高倍鏡視野進行觀察。CD34 陽性標(biāo)準(zhǔn)定位于小血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜/胞漿，呈棕黃色表達。結(jié)果用IPP6.0軟件測定積分光密度(IOD)值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟一般情況的比較對照組肝臟呈鮮紅色，質(zhì)地軟，表面光滑，光澤度明顯。模型組肝臟呈暗紫色，肝整體可見大面積壞死、水腫，被膜腫脹，大部分肝臟表明凹凸不平，可見大小不等癌結(jié)節(jié)。個別表面有明顯粟粒樣改變，呈肝硬化表現(xiàn)，艾迪治療組肝臟呈暗紅色，質(zhì)地較軟，表面尚光滑，偶可見表面有少量結(jié)節(jié)。

2.2 艾迪注射液對大鼠血清ALT、AST、ALP 的影響與對照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP 均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，艾迪注射液處理組ALT、ALP 明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），各組ALT、AST 和ALP 水平見表1。

表1 大鼠血清中各組ALT、AST、ALP水平（±s,U/L）

表1 大鼠血清中各組ALT、AST、ALP水平（±s,U/L）

注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別對照組模型組艾迪注射液組F值P值樣本數(shù)10 10 10 ALT/( U/L)51.10.10±5.90 251.18±30.16#178.20±85.93#*305.089 0.000 AST/( U/L)41.64±10.40 97.77±17.69#99.85±18.81#42.199 0.000 ALP/( U/L)55.04±12.47 109.77±15.61#92.76±24.58#*23.454 0.000

2.3 HE 染色及Masson 染色結(jié)果HE 染色結(jié)果顯示，對照組肝小葉形態(tài)正常，肝臟結(jié)構(gòu)完整，低倍鏡下肝細(xì)胞呈條索狀排列整齊，如圖1a；模型組肝組織低倍鏡下肝臟結(jié)構(gòu)被破壞，可見大片肝壞死，可見大量纖維組織增生，匯管區(qū)成纖維細(xì)胞大量增生，肝血竇間隙變寬，可見大量結(jié)締組織增生并向小葉內(nèi)延伸形成典型的假小葉，如圖1b。高倍鏡下可見癌變的肝細(xì)胞變大，呈大的多邊形、類圓形多核，核仁明顯，細(xì)胞不規(guī)則排列，有大量脂肪變性和水腫，其間薄層纖維組織分割，壞死的癌組織中呈灶狀分布，炎癥細(xì)胞少見，如圖1B；艾迪注射液處理組低倍鏡下肝臟結(jié)構(gòu)可見大量結(jié)締組織增生并向小葉內(nèi)延伸形成典型的假小葉，有大量炎細(xì)胞浸潤，肝臟標(biāo)本可見小葉內(nèi)有干酪樣壞死，如圖1c。高倍鏡下可見癌變的肝細(xì)胞，還有大量的脂肪空泡和水腫，如圖1C。

圖1 各組肝臟組織HE染色

Masson 染色結(jié)果顯示，對照組呈正常肝組織形態(tài)，未見明顯膠原纖維增生。模型組看見大量藍(lán)色膠原纖維將肝組織分割成不規(guī)則形狀，看見膠原纖維分割出來的假小葉緊緊將癌細(xì)胞包圍，膠原纖維作為分割線將正常肝組織和癌組織分隔開，如圖2b；高倍鏡下可見膠原纖維包裹下的大量壞死區(qū)，如圖2B；艾迪注射液處理組肝組織低倍鏡下可見大量膠原纖維分隔形成的假小葉，肝細(xì)胞間隙有大量的橘紅色的紅血球，如圖2C。

圖2 各組肝臟組織Masson染色

2.4 免疫組織化學(xué)染色α-SMA 陽性結(jié)果呈棕黃色，表達于非成對動脈、無明顯靜脈、膽管及結(jié)締組織伴行的的動脈），主要反映肝臟腫瘤血管生成。對照組呈低表達，主要表達于動靜脈血管周圍，如圖3A；模型組在癌組織周圍可見大量的陽性表達，大量的非成對的動靜脈血管分布于癌組織中，呈不規(guī)則圓形，橢圓形，如圖3B;艾迪注射液處理組在形成假小葉的膠原纖維中散在分布著呈棕黃色的陽性表達，如圖3C。

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測各組兔肝組織中α-SMA的表達

CD34陽性染色為血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，腫瘤微血管分布不均，表現(xiàn)出明顯異質(zhì)性，在癌組織、新生癌巢周邊及纖維包膜中CD34 呈陽性細(xì)胞，微血管分布明顯。對照組呈低表達，主要表達于動靜脈血管周圍，如圖4A；模型組在癌組織可見大量的陽性表達，肝細(xì)胞壞死區(qū)、膠原纖維及部分肝癌細(xì)胞均及血管周圍均呈陽性表達，如圖4B；艾迪注射液處理組在形成假小葉的膠原纖維中散在分布著呈棕黃色的陽性表達，動靜脈血管周圍呈陽性表達，如圖4C。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測各組兔肝組織中CD34的表達

與對照組比較，模型組、艾迪注射液處理組肝癌組織中α-SMA 表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，艾迪注射液處理組的α-SMA明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與對照組比較，模型組、艾迪注射液處理組肝癌組織中CD34 表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，艾迪注射液處理組的CD34 明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）,見表2。

表2 α-SMA和CD34在各組大鼠肝臟組織的表達情況（±s）

表2 α-SMA和CD34在各組大鼠肝臟組織的表達情況（±s）

注：與對照組比較，#P<0.01;與模型組比較，*P<0.01；與艾迪注射液處理組組比較，▲P<0.01。

組別對照組模型組艾迪注射液組F組P值n 10 10 10 α-SMA 119.78±25.85*▲12746.23±2909.66#▲7655.93±1232.45#*100.21<0.01 CD34 109.73±21.34*▲8311.58±1365.47#▲5906.61±1058.74#*143.11<0.01

3 討論

肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素的進程，一些DNA 損傷性化學(xué)物質(zhì)與細(xì)胞毒物質(zhì)被認(rèn)為肝癌發(fā)生的根本原因，二乙基亞硝胺（DEN）是一種誘發(fā)原發(fā)性肝癌的化學(xué)藥物[9-10]，DEN 在大鼠體內(nèi)最終可以轉(zhuǎn)化為烷基化代謝物，此代謝物可以導(dǎo)致DNA 加合物的形成，隨后轉(zhuǎn)化為中間體，促使了甲基化，DEN 的成瘤最關(guān)鍵的是由于DNA 中的O6 與N-7甲基鳥嘌呤的形成，使得遺傳信息的改變，形成啟動的致癌細(xì)胞。已有研究選用Walker-256 細(xì)胞接種于大鼠肝臟，21 d即可看見在肝臟出現(xiàn)乳白色菜花樣占位性瘤體，證實了Wistar大鼠更適用于制作肝癌模型[11]。

艾迪注射液主要包括刺五加、人參、斑螯、黃芪等，組方以斑蝥為君藥，斑螯素為斑螯的主要成分，也是抗惡性腫瘤的有效成分，具有較好的抗腫瘤作用，其在抑制腫瘤細(xì)胞的同時卻對機體無明顯免疫抑制作用，對白細(xì)胞數(shù)量不產(chǎn)生影響[6]。人參、黃芪、刺五加為佐藥[12-13]，屬扶正固本類藥物，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，艾迪注射液具有扶正祛邪的雙重功效。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為艾迪注射液具有清熱解毒、消瘀、散結(jié)的作用。本研究采用DEN 化學(xué)試劑制備大鼠肝癌模型，探討艾迪注射液的價值。

ALT和AST是衡量肝臟代謝功能的重要的指標(biāo)，當(dāng)肝臟受損嚴(yán)重時，血清中ALT、AST 會顯著升高[14]。ALP 主要用于診斷肝膽及骨骼系統(tǒng)疾病,是反映肝內(nèi)占位性病變、肝外膽道梗阻和佝僂病的重要指標(biāo)[15]。本研究通過測定大鼠血清中ALT 和AST 和ALP 水平，觀察艾迪注射液的護肝作用。艾迪注射液干預(yù)后，大鼠ALT 和ALP 水平含量明顯下降，提示大鼠肝臟功能在艾迪注射液的干預(yù)下有所恢復(fù)。

本研究的病理結(jié)果證實了大鼠肝癌模型制作成功，從HE 染色和Masson 染色中，模型組動物肝臟可以看見大量藍(lán)色膠原纖維將肝組織分割成不規(guī)則形狀，看見膠原纖維分割出來的假小葉緊緊將癌細(xì)胞包圍，符合肝癌模型的病理特征[16]。經(jīng)艾迪注射液干預(yù)后，本研究病理結(jié)果顯示：肝臟壞死區(qū)變小，增生的膠原纖維分隔的假小葉變少，但是癌變的肝細(xì)胞和大量脂肪空泡仍然存在。說明艾迪注射液可能有治療作用，但是因為本研究設(shè)定了一個干預(yù)劑量，無法判斷是干預(yù)劑量不足或是治療時間不足，后續(xù)本研究將會進一步深入探討艾迪注射液的作用。

在肝癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤血管的生成起著至關(guān)重要的作用。在肝癌組織中，可以看到血竇是由一圈扁平梭狀細(xì)胞連接而成，這種梭狀細(xì)胞就是由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，內(nèi)皮細(xì)胞上α-SMA 為強陽性表達[17]。本研究中α-SMA 在對照組肝臟中央靜脈、匯管區(qū)血管均為弱陽性表達或不表達，在模型組肝臟肝血竇及匯管區(qū)血管均為強陽性表達。艾迪注射液治療后，腫瘤細(xì)胞α-SMA 表達有明顯抑制作用。艾迪注射液能抑制肝癌腫瘤細(xì)胞α-SMA 蛋白的表達，提示其具有潛在的抗腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的作用。

CD34 的陽性表達程度與毛細(xì)血管密集程度有關(guān)，是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要原因[18]。CD34 在正常的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中不表達，但可以作為微血管的標(biāo)志，反映肝竇毛細(xì)血管化的程度。本研究以CD34 作為肝癌細(xì)胞的標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)在癌組織、新生癌巢周邊及纖維包膜中CD34 呈陽性細(xì)胞，微血管分布明顯。與對照組比較，模型組和艾迪注射液處理組CD34 的表達明顯升高，提示肝癌組織中CD34 出現(xiàn)了明顯的陽性表達。經(jīng)艾迪注射液干預(yù)后與模型組相比，CD34 表達明顯降低，提示艾迪注射液治療組對肝癌組織中CD34 的表達有降低作用，可能利于阻斷新生血管的生成。

綜上所述，艾迪注射液治療DEN 所致肝癌大鼠后，大鼠肝臟a-SMA 和CD34 表達有降低趨勢。艾迪注射液可能通過抑制a-SMA 和CD34 的表達，抑制腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌的作用。后續(xù)實驗可采用不同劑量艾迪注射液對大鼠肝癌模型進行干預(yù)，并對a-SMA 和CD34 相關(guān)信號通路相關(guān)因子進行檢測，為肝癌候選藥物的研究提供依據(jù)。