袁長(zhǎng)深 容偉明 李 哲 官巖兵 梅其杰 段 戡

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨三科，廣西南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧 530000

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種伴隨結(jié)構(gòu)改變的關(guān)節(jié)疼痛綜合征，是最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病。目前其發(fā)病機(jī)制不明確，缺乏有效手段逆轉(zhuǎn)該病的進(jìn)程[1]，其導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛、殘疾問(wèn)題較為突出，加之該病容易喪失勞動(dòng)力，故將其防治作為區(qū)域衛(wèi)生政策的優(yōu)先事項(xiàng)對(duì)待，甚至建議通過(guò)修訂有關(guān)OA 臨床和公共政策加以重視[2]。

軟骨細(xì)胞死亡/存活在OA 發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。在OA 的軟骨細(xì)胞中，自噬相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)顯著降低，表明自噬可能是OA 重要的發(fā)病機(jī)制[3]，甚至決定OA 的命運(yùn)[4]。自噬雖不是細(xì)胞死亡的方式，但可通過(guò)清除受損和功能失調(diào)的細(xì)胞器和大分子，維持OA軟骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)自噬平衡機(jī)制，可作為延緩關(guān)節(jié)衰老和降低OA 風(fēng)險(xiǎn)的一種新途徑[5]。

目前關(guān)于OA 自噬的研究仍處于早期階段，利用生物信息學(xué)方法挖掘自噬參與OA 發(fā)生、發(fā)展的重要基因及通路，可從一個(gè)新角度更好地闡明OA 發(fā)病機(jī)制，也為開(kāi)發(fā)新藥提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心建立的GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的GEO DataSets 檢索窗口，以“Osteoarthritis”為檢索詞，同時(shí)限制條目類型為DataSets、研究的類型為Expression profiling by array、種屬類型為homo sapiens 和公開(kāi)日期為2010 年1 月1 日至2020 年1 月1 日，基于GPL96 平臺(tái)，最終篩選得到基因微陣列數(shù)據(jù)集（GSE55457）；該數(shù)據(jù)集包含10 例正常和10 例OA 關(guān)節(jié)的滑膜組織，將其分別作為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。

1.2 差異表達(dá)基因篩選

使用R 軟件limma 包對(duì)20 例樣品（對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組）的表達(dá)矩陣進(jìn)行校正和分位數(shù)歸一化，再利用高級(jí)的t 檢驗(yàn)分析并根據(jù)假設(shè)檢驗(yàn)對(duì)P 值進(jìn)行校正，篩選出校正后P ＜0.05 和|logFC|>1 的基因作為差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），并構(gòu)建火山圖。

1.3 OA 自噬基因的篩選

通過(guò)GeneCards 網(wǎng)站使用“自噬”檢索詞獲取自噬相關(guān)基因。由于相關(guān)性評(píng)分被用來(lái)表示基因與自噬活性之間的強(qiáng)度，本研究將相關(guān)性評(píng)分≥1 分的基因作為自噬相關(guān)基因。將差異分析獲得的DEGs 與自噬相關(guān)基因進(jìn)行交集，利用R 軟件Venn Diagram 包繪制交集圖，交集基因即為OA 自噬基因。

1.4 GO 和KEGG 富集分析

對(duì)篩選出的基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，可清楚其在疾病中的主要功能和途徑，有助于深入研究疾病的機(jī)制。通過(guò)R 軟件中Bioconductor 軟件包對(duì)交集基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，篩選出校正后P ＜0.05 的結(jié)果，再利用ggplot2 包對(duì)顯著富集的結(jié)果分別進(jìn)行可視化。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析

通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)在線構(gòu)建交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，并設(shè)定篩選閾值為0.4，獲得交集基因編碼的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，再將PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，并使用MCODE 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)聚類，以篩選出主要模塊，最后對(duì)其基因再次做KEGG 富集分析，比較兩種基因所得信號(hào)通路的異同。

1.6 Hub 基因的選擇

使用CytoHubba 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)度、最大鄰域分量、緊密度、放射性、壓力5 種方法篩選出關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 DEGs 的篩選

使用R 軟件對(duì)GSE55457 數(shù)據(jù)集中的20 例滑膜樣品歸一化后，比較各基因在OA 滑膜組織和正常者滑膜組織之間的表達(dá)差異，篩選同時(shí)符合校正后的P ＜0.05 和|LogFC|>1 的差異基因，共得到203 個(gè)DEGs，包括上調(diào)基因55 個(gè)和下調(diào)基因148 個(gè)。見(jiàn)圖1（封三）。

圖1 差異表達(dá)分析的火山圖

2.2 OA 自噬基因的篩選

通過(guò)GeneCards 網(wǎng)站獲得符合條件即自噬關(guān)聯(lián)評(píng)分≥1 分的自噬基因5786 個(gè)，再與DEGs 交集，共獲得65 個(gè)OA 自噬基因。見(jiàn)圖2。

圖2 自噬基因與骨關(guān)節(jié)炎差異基因的交集

2.3 GO 和KEGG 富集分析

利用R 軟件對(duì)篩選出的65 個(gè)OA 自噬基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，結(jié)果顯示有279 個(gè)GO 條目和44 個(gè)KEGG 條目；其中與OA 密切相關(guān)的GO 分析主要富集在調(diào)控DNA 生物合成過(guò)程、負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化、轉(zhuǎn)移酶活性的負(fù)調(diào)控和血管生成的調(diào)節(jié)等（圖3，見(jiàn)封三）；與OA 高度相關(guān)的KEGG 通路有MAPK、TNF、JAK-STAT 和PI3K-Akt 等通路（圖4，見(jiàn)封三）。

圖3 GO 富集分析結(jié)果

圖4 KEGG 富集分析結(jié)果

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析

通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建交集基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)，其節(jié)點(diǎn)數(shù)目有64 個(gè)，邊數(shù)是129 條，PPI 網(wǎng)絡(luò)的P 值小于1.0e-16（圖5）。另外利用MCODE 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，得到一個(gè)較為重要的模塊，其包含9 個(gè)基因（圖6），對(duì)其進(jìn)行KEGG 富集分析得到MAPK、JAKSTAT 和PI3K-Akt 信號(hào)通絡(luò)較為重要（圖7，見(jiàn)封三），這與OA 自噬基因富集分析得到結(jié)果大致相同。

圖5 交集基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中較為重要的模塊

圖7 模塊基因的KEGG 富集分析

2.5 Hub 基因的選擇

本研究通過(guò)5 種計(jì)算方法均篩選出前10 位的關(guān)鍵基因，并利用“Venn”軟件對(duì)其進(jìn)行交集和可視化，獲得7 個(gè)關(guān)鍵基因，包括VEGFA、JUN、CTNNB1、MYC、NR4A1、MAP2K7 和DUSP1。見(jiàn)圖8。

圖8 5 種計(jì)算方法前10 個(gè)基因的交集

3 討論

OA 是最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，而自噬可能在OA 發(fā)病中起到重要作用[3]，同時(shí)鑒于OA 發(fā)病與復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)[6]，因而通過(guò)生物信息學(xué)挖掘參與OA 發(fā)生、發(fā)展的自噬重要基因、通路，探究其分子機(jī)制。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MAPK、JAKSTAT 和PI3K-Akt 通路在OA 自噬中發(fā)揮重要作用。在OA 中，MAPK 途徑的激活不僅增加軟骨和滑液中IL-1、TNF-α、NO 和基質(zhì)金屬蛋白酶-13 的含量[7]，而且可抑制自噬的發(fā)生[8]，同時(shí)通過(guò)抑制MAPK 通路引起下游反應(yīng)可有效地控制OA 的進(jìn)展[7]。JAK-STAT 通路的發(fā)生是通過(guò)激活JAK 激酶而使STAT 磷酸化，接著2 個(gè)磷酸化的STAT 在核內(nèi)與靶基因啟動(dòng)子中特異DNA 序列結(jié)合，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等[9]；STAT3 作為一種新的自噬調(diào)節(jié)劑，其通過(guò)與PKR 結(jié)合使磷酸化的eIF2A 失活以減少自噬途徑[10]，因此JAK-STAT 信號(hào)通路也介導(dǎo)著自噬的發(fā)生[11]，但通過(guò)該途徑探討OA 的機(jī)制研究甚少，后期可通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討其相關(guān)性。PI3K-AKT 作為調(diào)控自噬的經(jīng)典傳導(dǎo)通路，PI3K 的激活可使Akt 磷酸化并引起下游一系列反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平下降[12-13]，而通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路可提高細(xì)胞自噬來(lái)改善軟骨的損傷[14]。

此外，本研究通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)關(guān)鍵基因。VEGFA 可引發(fā)滑膜增生和軟骨破壞，導(dǎo)致OA 的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。雖然未見(jiàn)有VEGFA 與OA 自噬的報(bào)道，但認(rèn)為由于自噬功能低下而無(wú)法抑制VEGFA 表達(dá)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的持續(xù)繁殖，通過(guò)激活自噬可有效控制病情發(fā)展[17]。JUN 屬于原癌基因c-Jun 的表達(dá)產(chǎn)物，在轉(zhuǎn)導(dǎo)偶聯(lián)信息傳遞中起到核內(nèi)“第三信使”作用。c-Jun在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨組織中呈高表達(dá)狀態(tài)[18]，可加速OA 軟骨損傷。CTNNB1（又稱“β-catenin”）是Wnt 信號(hào)通路必不可少的蛋白，該途徑可調(diào)節(jié)自噬、細(xì)胞凋亡和增殖等[19]。β-catenin 在OA 滑膜組織中呈高表達(dá)，不僅可引起滑膜成纖維細(xì)胞病理改變[20]，而且可抑制軟骨細(xì)胞自噬的激活，導(dǎo)致OA 發(fā)展[21]。MYC基因家族成員包括c-myc、n-myc 及l(fā)-myc，通過(guò)影響細(xì)胞增殖、分化、自噬和凋亡過(guò)程在疾病中發(fā)揮作用[22]。c-myc 在OA 軟骨中呈高表達(dá)，參與OA 發(fā)展[23]；有效抑制MYC 表達(dá)可增強(qiáng)自噬水平，從而延緩OA 的進(jìn)程[24]。NR4A1 被認(rèn)為是調(diào)控OA 發(fā)展的一種調(diào)節(jié)劑[25]，其作為T(mén)NF/p38 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的下游介質(zhì)，通過(guò)影響軟骨細(xì)胞的凋亡或自噬在OA 發(fā)展中發(fā)揮作用[26]。MAP2K7 是MAPK 信號(hào)通路中一種重要的激酶，通過(guò)JNK 途徑可調(diào)節(jié)OA 中的炎癥反應(yīng)，是研發(fā)藥物治療OA 的新靶標(biāo)[27]。DUSP1（又稱“MKP-1”）可通過(guò)MAPK通路發(fā)揮對(duì)OA 的調(diào)控作用[28]；另外有研究發(fā)現(xiàn)降低或敲除DUSP1 的表達(dá)，可促進(jìn)MAP1/LC3-Ⅱ水平升高，激活細(xì)胞自噬[29]，因而DUSP1 可能通過(guò)自噬影響OA 進(jìn)展。

本研究通過(guò)對(duì)OA 基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)與OA自噬基因的分析，挖掘出OA 中與自噬激活相關(guān)的重要基因、通路，從自噬角度闡明OA 的發(fā)病機(jī)制，為研究OA 的分子機(jī)制提供一種新的思路。然而，本研究根據(jù)大數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)出的分子機(jī)制，仍需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。