賈英杰 張曉博 張新元 楊紅霞 郭爭榮

肝纖維化是慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)以及細胞外基質(zhì)沉積和代謝失衡的結(jié)果，對于肝纖維化以及早期肝硬化階段，通過一定的干預(yù)治療，是可以逆轉(zhuǎn)的[1,2]。研究顯示肝星狀細胞的活化及表型轉(zhuǎn)化是肝纖維化發(fā)生及進展的中心環(huán)節(jié)[3,4]，活化的肝星狀細胞高度表達α-SMA，分泌Ⅰ、Ⅱ型膠原，導致細胞外基質(zhì)的過度沉積進而促進肝纖維化的發(fā)生及進展[5,6]。盡管肝纖維化的發(fā)生機制的闡明已經(jīng)取得了重大進展，但仍然缺乏有效的抗纖維化策略[7,8]。肝纖維化機制的闡明及有效的抗肝纖維化藥物的研發(fā)與應(yīng)用是近年來本領(lǐng)域關(guān)注的熱點。然而中藥在抗肝纖維化治療中具有多層次、多途徑、多靶點的綜合作用，本課題組采用的強肝膠囊由丹參、茵陳、黃芪、山楂、山藥、甘草等16味中藥組成，具有活血軟堅、化痰除濕等功效。本研究采用豬血清誘導的大鼠Wistar肝纖維化模型，同時采用水分薊賓膠囊作為陽性對照組，應(yīng)用強肝膠囊進行應(yīng)用研究，明確強肝膠囊能否有效延緩/阻止肝纖維化進展，為肝纖維化的治療提供新的策略及科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 在河北醫(yī)科大學動物實驗中心購買基因純正的Wistar大鼠80只(合格證號：603100)，均為雄性，清潔級，平均體重為(180±20)g。強肝膠囊的制造廠家為石家莊東方藥業(yè)公司，批準文號：國藥準字Z10980012。水飛薊賓膠囊的制造廠家為天津天士力圣特制藥公司，批準文號：國藥準字H20040299。豬血清的制造廠家為北京燕生政博生物科技公司，冰醋酸的制造廠家為天津市瑞金化工公司，異氟烷的制造廠家為山東科苑制藥公司諾耀眼集團，ALT、AST、γ-GT、MDA、LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1試劑盒購于上海海軍醫(yī)學研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物肝纖維化模型建立：正常組20只，用普通飲用水喂養(yǎng)。模型組60只，每次向大鼠腹腔注射滅活豬血清0.5 ml，每周2次，持續(xù)10周，期間不限制飲水及飲食。為了維持肝纖維化病因的連續(xù)有效刺激，避免大鼠肝纖維化模型的自然恢復(fù)，仍在治療過程中給予這些大鼠每只每周2次注射0.5 ml豬血清。

1.2.2 實驗動物分組及給藥：經(jīng)過10周造模成功后，把模型組60只大鼠隨機分成3個小組，分別為B、C、D組，每小組20只大鼠。其中，肝硬化模型(B組)大鼠只給予日常需要的普通飲用水，水飛薊賓組(C組)大鼠除了給予日常需要的普通飲用水外，還給予7 mg·kg-1·d-1的水飛薊賓膠囊灌胃，強肝膠囊組(D組)大鼠除了給予日常需要的普通飲用水外，還給予0.53 g·kg-1·d-1的強肝膠囊灌胃，治療時間均為8周。A組為對照組。

1.2.3 標本采集與處理：采集標本前，大鼠均禁食12 h，不禁水，給每只大鼠稱重并記錄。將大鼠用異氟烷吸入麻醉后立即剖開腹腔，經(jīng)腹主動脈采血，靜置4 h 后，以3 000 r/min離心后收集上層血清，按照各檢測試劑盒的需要量分裝，置于-80℃的冰箱保存。采血完畢后，立即暴露大鼠肝臟，觀察并記錄肝臟的外形、色澤、表面情況及質(zhì)地等情況。

1.2.4 臟器指數(shù)：剖開大鼠腹腔后，迅速取出肝臟、脾臟和胸腺，于0.9%氯化納溶液中充分清洗，分別稱重記錄。肝組織部分采用4%中性甲醛溶液固定，備行肝組織病理學檢測。臟器指數(shù)=臟器的重量(g)/解剖前的體重(g)。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學變化 肝組織標本使用HE染色方法檢測病理學變化，A組肝小葉結(jié)構(gòu)均正常，肝索排列整齊；B組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見點、灶狀肝細胞壞死及竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生，纖維間隔形成；D組纖維間隔明顯變細變短，肝纖維化程度較肝纖維化模型組明顯減輕；C組纖維間隔稍變細變短，肝組織纖維化程度亦較模型組好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 肝組織病理學變化(HE×200)；A 對照組；B 模型組；C 水飛薊賓組；D 強肝膠囊組

2.2 4組大鼠臟器指數(shù) 與A組的正常組大鼠比較，B、C組模型組的肝臟和脾臟指數(shù)明顯上升(P<0.05)，但胸腺指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，D組強肝膠囊組的肝臟、脾臟和胸腺指數(shù)均明顯上升(P<0.05)；與B、C組模型組比較，D組強肝膠囊組的脾臟和胸腺指數(shù)上升(P<0.05)，但肝臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠臟器指數(shù)比較

2.3 4組大鼠肝組織ALT、AST、γ-GT、MDA含量 與A組正常組比較，B組模型組ALT、AST、γ-GT的含量明顯升高(P<0.05),但MDA含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與B組模型組比較，D組強肝膠囊組和C組水飛薊賓膠囊組ALT、AST、γ-GT的含量明顯減少(P<0.05)，但MDA含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與C組水飛薊賓膠囊組比較，D組強肝膠囊組ALT、AST、γ-GT的含量明顯減少(P<0.05)，但MDA含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4 4組大鼠肝組織LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量 與A組正常組比較，B、C、D組模型組LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量明顯上升(P<0.05)；與B組模型組比較，D組強肝膠囊組LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量明顯減少(P<0.05)。見表3。

表2 肝組織ALT、AST、γ-GT、MDA含量

表3 肝組織LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量

2.5 4組大鼠血清LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量 與A組正常組比較，B、C組模型組LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量明顯上升(P<0.05)，D組強肝膠囊組HA含量明顯上升(P<0.05)，但LN、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與B組模型組比較，D組強肝膠囊組LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量明顯減少(P<0.05)。見表4。

表4 血清LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量

3 討論

肝纖維化/肝硬化屬于中醫(yī)“積聚”范疇，究其基本病機為肝脾同病、氣虛血瘀，以氣虛和血瘀的證候表現(xiàn)為辨證要點。本課題采用的強肝膠囊，具有活血軟堅、化痰除濕等功效[9]。丹參具有活血祛瘀，清熱涼血、通經(jīng)止痛之功效，其抗肝纖維化的作用明確，通過下調(diào)細胞因子、減少膠原組織的合成、阻斷肝臟枯否細胞和肝星狀細胞的活化、以及促進肝臟快速清除自由基等來發(fā)揮作用[10]。強肝膠囊中含有黨參、當歸、丹參、黃芪成分,具有保護肝細胞、減輕炎癥壞死的作用,故可達到保肝、降酶的功效[11]。實驗性肝損傷的研究發(fā)現(xiàn)，茵陳可以降低肝細胞的炎癥程度，促進肝細胞炎癥的恢復(fù)[12]。相比于化學藥物，中藥的優(yōu)點是多方面、多靶點和多層面的，從整體上系統(tǒng)地調(diào)控各靶點抑制肝纖維化的進展[13]。

有研究報道，豬血清以異種抗原的身份侵入機體，刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使肝臟出現(xiàn)了纖維化，或者以炎癥刺激因子的身份來刺激機體被動釋放出大量細胞因子，激活肝星狀細胞，使細胞外基質(zhì)出現(xiàn)異常沉積，而引起肝纖維化[14]。本研究之所以采用豬血清來誘導肝纖維化模型，是因為豬血清誘導的肝纖維化模型具備很多優(yōu)點，如：肝纖維化持續(xù)時間長、自愈率低、對肝細胞損傷較小、有較強的免疫應(yīng)答能力、對實驗結(jié)果影響小等，最重要的是，其誘導的肝纖維化的發(fā)生機制與臨床上慢性肝炎所致肝纖維化的發(fā)生機制接近[15,16]。

在本研究中，D組強肝膠囊組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均比B組模型組高，提示強肝膠囊可在一定程度上提高機體免疫力。眾所周知，脾臟和胸腺是機體非常重要的免疫器官，其臟器指數(shù)的高低與免疫功能的強弱及免疫活性細胞的數(shù)量有關(guān)[17]。

目前，肝纖維化的診斷多采用非創(chuàng)傷性診斷體系，包括細胞外基質(zhì)及其轉(zhuǎn)化的相關(guān)物質(zhì)，如LN、HA、Ⅳ-C以及TGF-β1等[18]。研究表明，肝纖維化時細胞外基質(zhì)異常增生，沉積的主要成分是COL-Ⅰ、PCⅢ，基底膜的主要成分LN、Ⅳ-C在基底膜增生、肝竇毛細血管纖維化過程中含量增加[19]。其血清含量與肝纖維化的嚴重程度密切相關(guān)，能較客觀的反映肝纖維的合成狀況及炎癥的活動性[20]，是肝纖維化早期的檢測標志，隨著病程進展，其在血清中的含量逐步升高，因此也是觀察藥物療效和預(yù)后的重要依據(jù)之一。

為進一步了解強肝膠囊對肝纖維化的治療效果，本實驗使用強肝膠囊治療大鼠肝纖維化。血清生化指標異常，表示肝內(nèi)炎癥損害，ALT多見于肝細胞漿內(nèi)，AST多見于肝細胞線粒體內(nèi)[21]。結(jié)果顯示強肝膠囊組的血清學及肝組織指標ALT、AST、γ-GT、LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1遠低于模型組，提示大鼠肝纖維化程度減輕。黎桂玉等[22]指出：強肝膠囊對慢性肝炎血清HA、PⅢP、Ⅳ-C和LN的作用明顯優(yōu)于對照組，且無嚴重不良反應(yīng)發(fā)生，歐強等[23]在治療過程中亦未見明顯不良反應(yīng)。

此外，有研究證實，TGF-β1能反映肝臟炎性反應(yīng)的活動性，并與肝臟纖維化水平密切相關(guān)。TGF-β1可以通過誘導肝星狀細胞的異常增殖導致細胞外基質(zhì)的增加，從而上調(diào)LN、HA等的表達，破壞基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑的平衡狀態(tài)，從而促使肝纖維化發(fā)生發(fā)展[24]。在本研究中，強肝膠囊組治療后TGF-β1水平下降，表明強肝膠囊可以抑制TGF-β1的產(chǎn)生，可以通過降低TGF-β1的水平來減少肝臟細胞外基質(zhì)的異常沉積，從而達到改善、治療肝纖維化的目的。吳翠萍等[25]的研究提示：強肝膠囊可以多靶位、多層次、多環(huán)節(jié)的發(fā)揮抗肝纖維化作用,從而達到延緩、阻止甚或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程,改善病情，這與田春閣等[26]的研究結(jié)果一致。

綜上，強肝膠囊在改善肝臟理化指標的基礎(chǔ)上，可多靶點發(fā)揮抗肝纖維化作用，但由于中藥的成分比較復(fù)雜，是其單一成分有效還是多種成分的共同作用的結(jié)果，還有待進一步研究。