李健，王海峰，劉陽(yáng)，羅明，謝南姿

上海市同濟(jì)醫(yī)院老年科，上海200065

隨著社會(huì)老齡化日趨嚴(yán)重，越來(lái)越多的老年患者罹患心、腦血管疾病。新近的調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)目前有高達(dá)2.3 億心、腦血管疾病患者，其中85%以上均是老年患者。心、腦血管病嚴(yán)重危害著老年人群[1]。故而明確心、腦血管病的病因并針對(duì)病因進(jìn)行有效的預(yù)防是當(dāng)今生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)之一。

目前，己成功確定了一些與心、腦血管疾病發(fā)生相關(guān)的因素，主要包括高齡、血脂異常、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖癥等。經(jīng)過不懈努力，在心、腦血管疾病危險(xiǎn)因子的干預(yù)方面取得了明顯成效，但這類疾病的發(fā)病率、病死率仍居高不下，甚至有上升的趨勢(shì)。

同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）是一種含硫氨基酸，于1932年由Devgnesud 首次發(fā)現(xiàn)。1969年研究者發(fā)現(xiàn)，高同型半胱氨酸尿癥，與致死性心、腦血管病有關(guān)，首次提出了高HCY 血癥可能是動(dòng)脈粥樣硬化病的危險(xiǎn)因素，從而確立了HCY 與心、腦血管病之間的關(guān)系[2]。近年來(lái)，大量的流行病學(xué)調(diào)查和臨床試驗(yàn)己經(jīng)證實(shí)血漿HCY 水平升高是心、腦血管缺血性疾病的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[3-6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：HCY 可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，損傷主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈等大血管的內(nèi)皮細(xì)胞、形成粥樣斑塊甚至附壁血栓。但是對(duì)于HCY 損傷內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)理尚不完全清楚。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）、RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Sigma 公司）、同型半胱氨酸（美國(guó)Sigma公司）、二甲基亞砜（美國(guó)Sigma 公司）、胰蛋白酶（美國(guó)Sigma 公司）、L-谷氨酰胺（美國(guó)Sigma 公司）、EDTA（美國(guó)Sigma 公司）、青霉素、鏈霉素（哈藥集團(tuán)制藥總廠）和PBS 緩沖液（美國(guó)HyClone 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代 取凍存于液氮中的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，37°C 水浴中復(fù)蘇2 min，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含5 mL RPMI1640 培養(yǎng)基的離心管中，1 500 r/min 離心5 min，棄上清；用RPMI1640 培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素，100 g/mL 鏈霉素和10% FBS) 懸浮細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)于含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，37°C 下培養(yǎng)，每2 d 換液1 次，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底后（100% confluence 用PBS 液清洗3 遍，置入1 mL 0.25%的胰蛋白酶，用倒置顯微鏡觀察，當(dāng)細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓時(shí)，立即加入含 10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基終止消化，用彎頭吸管反復(fù)吹打，使大多數(shù)細(xì)胞脫落，形成細(xì)胞懸浮液，顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1∶3 進(jìn)行接種傳代。

1.2.2 四唑鹽(MTT) 比色實(shí)驗(yàn) 在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，各孔加入MTT 溶液20 L，37°C，孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 L DMSO，振蕩15 min，使結(jié)晶溶解充分，選擇490 nm 波長(zhǎng)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BioRad,USA) 測(cè)定各孔吸光值，記錄結(jié)果。

1.2.3 細(xì)胞分組 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2.0×104/mL的密度接種在96 孔板中，每孔加100 L 細(xì)胞懸液，分為：（1）對(duì)照組，無(wú)其它處理，37 °C 下培養(yǎng)細(xì)胞48 h；（2）HCY 處理組，向細(xì)胞懸液中分別加入終濃度為0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L 和20 mmol/L 的HCY，37 °C 下培養(yǎng)細(xì)胞48 h；

1.2.4 VIII 因子免疫熒光染色 （1）將細(xì)胞爬片置于35 mm 或60 mm 細(xì)胞的培養(yǎng)皿里，PBS 洗3 遍；（2）4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3 遍；（3）0.2%Triton X-100 通透15 min，PBS 洗3 遍；（4）將二抗相同宿主的血清封閉30 min，PBS 洗3 遍；（5）一抗4°C 濕盒內(nèi)12 h，PBS 洗3 遍；（6）二抗室溫下避光2 h，PBS 洗3 遍；（7）DAPI 染核，顯微鏡下拍照；（8）以蒸餾水洗凈PBS，用甘油封印。

1.2.5 Western blot 參照相關(guān)文獻(xiàn)，在各組hUVEC混懸液中加入蛋白裂解液，4°C、12 000 r/min 離心20 min，行蛋白定量，繼之各取等量樣本行凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，浸于封閉液中1 h，將膜與一抗共育90 min，漂洗；再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗共育45 min，加等體積增強(qiáng)發(fā)光化學(xué)試劑共孵1 min，暗室內(nèi)將膜曝光后用相紙顯影，摸索曝光時(shí)間，直至電泳帶顯影，采用Smartscape 生物電泳圖像處理系統(tǒng)分析免疫復(fù)合物。

1.2.6 ELISA 檢測(cè)血漿NF-κB 采用ELISA 檢測(cè)血漿中NF-κB 含量。向96 微孔板中加入樣品蛋白或標(biāo)準(zhǔn)蛋白100 L，室溫孵育2.5 h；PBS 洗滌4 次，加入100 L 的1×檢測(cè)抗體，然后室溫孵育1 h；加入100 L 的1×辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫孵育45 min；洗滌4 次后加入100 L 的四甲基聯(lián)苯胺底物；加入50 L 終止液，450 nm 波長(zhǎng)下用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)各孔光OD 值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t 檢驗(yàn)法或方差分析法比較組間差異＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞鑒定 用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，單個(gè)細(xì)胞呈梭型、三角形等形態(tài)，細(xì)胞核圓型、胞漿透明，細(xì)胞呈鋪路石樣融合生長(zhǎng)。見圖1。

圖1 血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。

2.2 HCY 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷研究MTT 的檢測(cè)結(jié)果如表1所示：在HCY 處理組，隨著HCY 的濃度逐漸增加，內(nèi)皮細(xì)胞的OD 值逐漸下降，在HCY 0.1 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/L 時(shí)，HCY 對(duì)OD 值的影響與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在HCY 的濃度為2.5 mmol/L 時(shí)，OD 值較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；在HCY 5 mmol/L，10 mmol/L，20 mmol/L 時(shí) OD 值較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見圖2。

圖2 不同的HCY 濃度影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的OD 值

表1 不同的HCY 濃度對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響

不同濃度的HCY 處理細(xì)胞48 h 后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HCY 的濃度為2.5 mmol/L 時(shí)細(xì)胞的存活率接近LD50，結(jié)合前面MTT 分析，HCY 的濃度為2.5 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力下降，因此本研究HCY 的干預(yù)均采用2.5 mmol/L 的濃度。見表1。

2.3 HCY 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞炎癥因子分泌的影響分別收集各組培養(yǎng)上清液并保存在-70°低溫冰箱中凍存?zhèn)溆?。IL-6 和E-選擇素均采用ELISA 法測(cè)定,嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。

2.3.1 HCY 對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素的影響在H CY 為2.5 mmol/L 孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后,內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素的分泌增加。在HCY 刺激后2 h E-選擇素升高，較0 點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),HCY刺激6 h E-選擇素的濃度達(dá)到峰值,隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng),E-選擇素的分泌逐漸減少,12～24 h 后,與對(duì)照組差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在HCY 刺激后的48 h E-選擇素的水平恢復(fù)到正常。見圖3。

圖3 HCY 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素的影響

2.3.2 HCY 對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6 的影響 在H CY2.5 mmol/L 干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中IL-6 的含量呈時(shí)間依賴性增加,內(nèi)皮細(xì)胞IL-6 的分泌在2.5 mmol/LHCY 刺激后逐漸升高，在4 h 后較升高較0 點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),6 h 時(shí)IL-6的含量仍呈上升趨勢(shì)，在HCY 刺激后12 h 后，IL-6的濃度達(dá)到峰值，較0 點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。隨后IL-6 的分泌逐漸下降,但在HCY 干預(yù)后的24 h時(shí)仍高于刺激前的基礎(chǔ)水平 (＜0.05),在48 h 時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液中HCY的濃度降至正常水平。見圖4。

圖4 HCY 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-6 的影響

2.4 HCY 對(duì)核因子B（NF-κB）表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分為正常組、2.5 mmol/L HCY 干預(yù)0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h 組，HCY 孵育后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)提取各組總蛋白，并行Western blot，從而比較各組NF-κB 蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。免疫印跡結(jié)果顯示：當(dāng)2.5 mmol /L 濃度的HCY 刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞后,NF-κB P65 的蛋白水平在0.5 h 即升高(＜0.01)，并達(dá)到高峰，隨后呈逐漸下降的趨勢(shì)，4 h 后基本恢復(fù)至基線水平。提示HCY 的刺激促進(jìn)了NF-κB 的活化。見圖5。

圖5 HCY 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB 的影響

3 討論

研究顯示，高HCY 血癥是心、腦血管病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血漿HCY 升高5 mol/L,引起動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)相當(dāng)于低密度脂蛋白膽固醇增加0.52 mmol/L[7]。高HCY 血癥引起心、腦血管病的機(jī)制目前尚不清楚,可能與內(nèi)皮細(xì)胞毒性、平滑肌細(xì)胞增殖、促脂質(zhì)過氧化和促血栓形成等相關(guān)[8-9]。

目前認(rèn)為動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)慢性炎癥性疾病過程。內(nèi)皮細(xì)胞受損釋放多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致白細(xì)胞(T 淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞) 的趨化聚集，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成、發(fā)展過程中起著重要作用[10]。動(dòng)脈粥樣硬化的形成、發(fā)展與粘附分子及細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)。E-選擇素于活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附[11]。IL-6 可誘導(dǎo)產(chǎn)生急性期蛋白,使淋巴細(xì)胞激活，從而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和血小板釋放。有研究發(fā)現(xiàn),E-選擇素及IL-6 mRNA 在動(dòng)脈粥樣斑塊中有表達(dá)[12]，冠心病患者血漿E-選擇素、IL-6 的水平升高，IL-6、E-選擇素可作為炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中,HCY (2.5 mmol/L)能誘導(dǎo)E-選擇素、IL-6 等細(xì)胞因子的合成和分泌增加,以上二個(gè)炎癥相關(guān)因子分別在6 h、12 h 達(dá)分泌高峰，維持升高狀態(tài)超過24 h，48 h 才逐漸恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)HCY 的刺激是一過性的，但是在人體，如果存在持續(xù)性的HCY 升高的刺激,其誘導(dǎo)全身血管內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素、IL-6 的分泌可能呈持續(xù)高水平，這無(wú)疑會(huì)加速血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)白細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮,進(jìn)而促使動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展。提示高HCY 具有潛在的促血管壁炎癥激活作用,這可能是HCY 誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型水平，證實(shí)HCY能誘導(dǎo)細(xì)胞因子E-選擇素、IL-6 的合成和分泌增加,同時(shí)促進(jìn)核因子kappaB（nuclear factor-κB，NF-κB）P65 表達(dá)上調(diào)，提示HCY 引起血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子釋放顯著增多可能與激活NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。炎癥因子的刺激在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。NF-κB 是產(chǎn)生炎癥因子的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中可檢測(cè)到活化的NF-κB[15]。NFB 是Rel 蛋白家族成員，激活血管平滑肌細(xì)胞NFB 后，血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎癥因子、粘附分子、生長(zhǎng)因子，單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在粘附分子介導(dǎo)下發(fā)生粘附和遷移內(nèi)皮下，導(dǎo)致血管壁慢性炎癥反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖及向內(nèi)膜移行,形成動(dòng)脈粥樣硬化[16-17]。因此，HCY 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成可能與通過激活NF-κB 信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子釋放，加速血管內(nèi)皮損傷有關(guān)。老年患者由于代謝率低，血漿中HCY 水平升高，對(duì)血管內(nèi)皮的損傷更為明顯。

總之,HCY 可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子的釋放與表達(dá),這些生物學(xué)過程是通過NF-κB 信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。如何干預(yù)這一信號(hào)通路，減少炎癥因子釋放，從而減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,對(duì)于伴有高HCY血癥的心、腦血管疾病患者、其中更多數(shù)是老年患者的防治有重要的科學(xué)價(jià)值。