陳艷霞，黃 翀，秦曉華，房向東，涂衛(wèi)平

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，南昌 330006)

慢性腎功能衰竭中腎小管細(xì)胞的凋亡不如急性腎功能衰竭中突出。然而，腎小管細(xì)胞凋亡是腎臟功能不全的關(guān)鍵特征，蛋白尿在慢性腎病的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。蛋白尿可誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(human renal tubular epithelial cells，HK-2)細(xì)胞的凋亡。在慢性腎功能衰竭中，很難確定在規(guī)定的時(shí)間范圍內(nèi)因凋亡而死亡的HK-2細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，但HK-2細(xì)胞凋亡對(duì)腎功能衰竭的促進(jìn)作用已被廣泛接受[1]。尿液中的白蛋白被認(rèn)為是危險(xiǎn)因素，對(duì)于如何緩解蛋白尿引起的腎功能衰竭問(wèn)題的研究有著重要意義，因?yàn)樗鼈兛赡艹蔀榭刂坡阅I病新的治療靶點(diǎn)。目前，阿托伐他汀(atorvastatin，ATO)對(duì)于白蛋白誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的凋亡影響尚不明確，因此，本研究旨在探討ATO對(duì)白蛋白誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

HK-2細(xì)胞來(lái)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；ATO購(gòu)自美國(guó)輝瑞制藥有限公司；RhoA/ROCK信號(hào)通路抑制劑(Y27632)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HK-2細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；HK-2細(xì)胞培養(yǎng)液中的胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；流式細(xì)胞檢測(cè)儀為美國(guó)Beck-man公司產(chǎn)品。RhoA、ROCK1及內(nèi)參(β-actin)引物序列見(jiàn)表1。

表1 RhoA、ROCK1、β-actin引物序列

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及分組

體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，將培養(yǎng)到85%～90%的HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為7組：空白對(duì)照組(A組)、白蛋白誘導(dǎo)組(B組：5 mg·mL-1白蛋白)、ATO組(C組：10-8mol·L-1ATO)、低濃度ATO+白蛋白誘導(dǎo)組(D組：10-10mol·L-1ATO+5 mg·mL-1白蛋白)、中濃度ATO+白蛋白誘導(dǎo)組(E組：10-9mol·L-1ATO+5 mg·mL-1白蛋白)、高濃度ATO+白蛋白誘導(dǎo)組(F組：10-8mol·L-1ATO+5 mg·mL-1白蛋白)、RhoA/ROCK信號(hào)通路阻斷劑組(G組：10 μmol·L-1Y27632+5 mg·mL-1白蛋白)；予以各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞的早期凋亡，采用RT-PCR檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞RhoAmRNA、ROCK1mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2細(xì)胞早期凋亡率

各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞干預(yù)48 h后，收集各實(shí)驗(yàn)組的HK-2細(xì)胞。PBS洗滌×2次(2000 r·min-1離心5 min)收集(1～5)×105細(xì)胞。加入500 μL Binding Buffer進(jìn)行HK-2細(xì)胞的重懸。加入5 μL Annexin V-FITC混勻后再加入5 μL Propidium Iodide，再次混勻。于室溫下，避光反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上檢測(cè)HK-2細(xì)胞的早期凋亡率。

1.4 RT-PCR檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞中RhoA、ROCK1 mRNA的表達(dá)

培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液后分別收集各實(shí)驗(yàn)組的HK-2細(xì)胞，用Trizol提取總RNA進(jìn)行RNA完整性檢測(cè)后，用核酸微量蛋白測(cè)定儀進(jìn)行RNA濃度的測(cè)定。取總RNA 1.5 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA 2 μL在2×EasyTaq PCR SuperMix的作用下擴(kuò)增目標(biāo)基因(以人β-actin為內(nèi)參照)，總反應(yīng)體系為50 μL。RhoA及ROCK1的引物序列如上所述。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，共35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物完成電泳后采用凝膠成像系統(tǒng)成像并使用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ATO對(duì)白蛋白誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞早期凋亡的影響

A組與C組HK-2細(xì)胞早期凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B組HK-2細(xì)胞早期凋亡率較其他各實(shí)驗(yàn)組升高明顯，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；D、E、F組HK-2細(xì)胞早期凋亡率較B組降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；D、E、F組HK-2細(xì)胞早期凋亡率組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；在D、E、F組中，干預(yù)用的ATO的濃度為逐漸升高，HK-2細(xì)胞早期凋亡率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)；G組HK-2細(xì)胞早期凋亡率與D、E、F組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；見(jiàn)表2，圖1。

表2 各組HK-2細(xì)胞早期凋亡率比較

圖1 各組HK-2細(xì)胞早期凋亡率情況

2.2 ATO對(duì)白蛋白誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中RhoA/ROCK1信號(hào)通路的影響

A組與C組RhoAmRNA、ROCK1mRNA的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B組與G組RhoAmRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而G組ROCK1mRNA的表達(dá)較B組明顯減少；D、E、F組HK-2細(xì)胞RhoAmRNA、ROCK1 mRNA的表達(dá)較B組減少(均P<0.05)；見(jiàn)圖2，表3。

*P<0.05與A組比；**P<0.05。圖2 各組HK-2細(xì)胞RhoAmRNA、ROCK1 mRNA的表達(dá)情況

表3 各組HK-2細(xì)胞RhoAmRNA、ROCK1 mRNA的表達(dá)情況

3 討論

慢性腎臟病的進(jìn)展過(guò)程中，除了有腎間質(zhì)的纖維化，還伴有腎小管的萎縮。而蛋白尿就是引起腎小管萎縮中HK-2細(xì)胞凋亡的危險(xiǎn)因素。研究表明，過(guò)量的白蛋白可以通過(guò)Fas信號(hào)途徑[2]、線粒體凋亡途徑[3]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4]、蛋白激酶B途徑[5]等引起HK-2細(xì)胞的凋亡。

目前，他汀類藥物是抗動(dòng)脈粥樣硬化治療的基礎(chǔ)藥物，具有廣泛的臨床應(yīng)用，尤其是心血管疾病方面，并且顯示出高效和良好的安全性。不僅如此，他汀類藥物在腎臟疾病方面，具有一定的臨床作用。BIANCHI等[6]的研究表明，在患有慢性腎臟病、蛋白尿和高膽固醇血癥的患者中，除了使用ACE抑制劑或ARB方案外，還可以使用ATO治療來(lái)降低蛋白尿和腎臟疾病的進(jìn)展速度；FUENTES等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在腎移植的同種異體移植前使用ATO，可以減少腎臟的急性炎癥負(fù)擔(dān)，并促進(jìn)移植后腎功能的恢復(fù)。ATO的預(yù)給藥可以通過(guò)其抗氧化作用保護(hù)腎臟免受亞胺培南誘導(dǎo)的腎毒性[8]。另外，ATO可以減輕心肌細(xì)胞凋亡[9]、抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[10]、抑制人類膽管癌細(xì)胞的凋亡[11]等。且ATO能改善碘普羅胺誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎損傷，其保護(hù)作用的機(jī)制可能與抑制HK-2細(xì)胞凋亡有關(guān)，且這種保護(hù)作用呈現(xiàn)劑量的依賴性[12]。ATO在造影劑腎損傷中具有保護(hù)作用，通過(guò)調(diào)控PERK/eIF2α/CHOP通路減輕造影劑誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡[13]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATO可以改善白蛋白誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的早期凋亡的發(fā)生。

已證實(shí)Rho相關(guān)螺旋形成蛋白激酶(ROCK-1和ROCK-2)參與平滑肌的收縮和細(xì)胞凋亡[14]。同時(shí)，Rho/ROCK信號(hào)途徑是調(diào)控細(xì)胞收縮和凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]。ATO可通過(guò)抑制ROCK信號(hào)通路來(lái)預(yù)防Ang Ⅱ誘導(dǎo)的人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的單層破裂，該機(jī)制的發(fā)現(xiàn)可以部分解釋他汀類藥物對(duì)心腦血管疾病(如顱內(nèi)動(dòng)脈瘤)的某些有益作用[16]。另有研究[17]表明，大劑量ATO可迅速抑制促動(dòng)脈粥樣硬化的Rho/ROCK途徑，而與膽固醇降低無(wú)關(guān)。辛伐他汀可通過(guò)下調(diào)ROCK的活性抑制小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新[18]。以上研究均提示，ATO在體內(nèi)的作用機(jī)制可能與調(diào)控Rho/ROCK信號(hào)通路有關(guān)，本研究結(jié)果顯示，D、E、F組HK-2細(xì)胞RhoAmRNA、ROCK1 mRNA的表達(dá)較B組減少，予以Y27632進(jìn)行RhoA/ROCK信號(hào)通路阻斷后，其HK-2細(xì)胞的早期凋亡率明顯下降，提示RhoA/ROCK信號(hào)通路參與白蛋白誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。而ATO發(fā)揮抑制白蛋白誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞早期凋亡作用的機(jī)制可能與部分阻斷RhoA/ROCK信號(hào)通路有關(guān)。

在臨床應(yīng)用中，ATO的安全性和耐受性至關(guān)重要。薈萃研究[19]分析提示現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，阿托伐他汀在其治療劑量范圍內(nèi)(10～80 mg·d-1)通常具有良好的耐受性。ATO對(duì)腎臟的作用具有劑量依賴性，在慶大霉素誘導(dǎo)的腎損傷模型研究[20]中發(fā)現(xiàn)，低劑量的阿托伐他汀對(duì)急性腎損傷中的腎小管上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究進(jìn)行了ATO在體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中10-8mol·L-1、10-9mol·L-1、10-10mol·L-13個(gè)濃度的探討，進(jìn)一步研究將繼續(xù)對(duì)ATO的濃度梯度進(jìn)行摸索。

本文目前局限在細(xì)胞水平的研究，動(dòng)物水平及人體水平ATO對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用及其可能機(jī)制需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討。本研究提示ATO可抑制白蛋白誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的早期凋亡，其作用機(jī)制可能與部分阻斷RhoA/ROCK信號(hào)通路有關(guān)，為臨床尋找延緩腎臟疾病進(jìn)展的治療新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。