劉付華，何 黎，顧 華※

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院清遠市人民醫(yī)院皮膚性病科，廣東 清遠 511500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科/云南省皮膚病性病研究所，云南 昆明 650032）

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，影響全世界10%～20%的兒童和1%～3%的成人[1]。AD的發(fā)病機制十分復(fù)雜，涉及遺傳因素、皮膚屏障的缺陷、免疫功能失調(diào)[2]。AD是以Th2型細胞因子優(yōu)勢表達為特點的慢性皮膚病，與皮膚細胞免疫相關(guān)并產(chǎn)生過多的IgE[3]。Th細胞分為3種亞類，PTh細胞，是指初始CD4+T細胞，主要分泌IL-2；Th1細胞，主要分泌IL-2、IL-12、IFN-r、TNF-a，并介導(dǎo)細胞免疫；Th2細胞，主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13，并介導(dǎo)體液免疫[4]。參與AD發(fā)病的細胞因子眾多，急性期AD皮損中Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA水平增高[5]，而Th1型細胞因子IL-12、IFN-r水平低。慢性期AD皮損中有大量IFN-r、IL-5、IL-12。說明AD中的細胞因子表達是雙相模式：即急性期以Th2型為主，慢性期以Th1型為主[6]。Elias等[3]認為特應(yīng)性皮炎患者表現(xiàn)為皮膚屏障功能異常，包括滲透屏障和抗微生物屏障的受損。提出特應(yīng)性皮炎發(fā)病的新理論，屏障功能破壞不再是單純的結(jié)果，而是濕疹發(fā)病的重要致病因素，并提出了AD外—內(nèi)—外的發(fā)病新模式[7-8]。

AD的基本治療包括最佳的皮膚護理，常規(guī)使用潤膚劑，解決皮膚的屏障缺陷和保持皮膚含水量，避免特異性和非特異性的觸發(fā)因素。外用糖皮質(zhì)激素是治療急性發(fā)作的主要藥物，但不能長期使用。局部外用他克莫司或吡美莫司等calcineurin抑制劑為二線治療。因此，AD的治療目前仍是比較困難，開發(fā)新的治療方法是必要的[9]。

透明質(zhì)酸（HA）是皮膚細胞外基質(zhì)的主要組成部分。HA在皮膚科的臨床應(yīng)用包括作為一種生物材料、生物工程用途、皮膚填充劑，也可促進傷口愈合、保濕[10]。馬齒莧是一種含許多生物活性化合物的草藥，具有抗炎、促進潰瘍愈合、抗真菌和抗氧化的作用[11]，含馬齒莧提取物膏藥應(yīng)用于燒傷、皮膚疾病、潤膚，可促進傷口愈合，并減少疼痛和炎癥。青刺果由于其富含油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、γ-亞麻酸等不飽和脂肪酸及豐富的脂溶性維生素，接近人體皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)的成分，因此具有保濕和皮膚再生修復(fù)作用，同時具有皮膚滲透能力[12]。青刺果的醫(yī)學(xué)護膚品可以補充皮膚角質(zhì)層水分，幫助皮膚恢復(fù)屏障功能，延緩皮膚老化，且耐受性很好[13]。本實驗使用含有透明質(zhì)酸、馬齒莧及青刺果油的生物活性貼膜治療BALB/c小鼠AD模型觀察其療效。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物：雄性SPF級純系BALB/c小鼠（購自北京維通利華實驗動物中心)，6周齡。實驗開始前放置在SPF實驗室中1周，使其適應(yīng)環(huán)境，房間溫度保持在（22±2）℃，濕度保持在（50±10）%，照明時間為早8點至晚8點，自由取食。主要試劑和儀器：小鼠炎癥因子定量抗體芯片1（Quantibody?Mouse Inflammation Array1、2,4硝基氯苯（DNCB）、4-乙氧基亞甲基-2-苯基惡唑啉-5-酮（OX）、丙酮、小鼠血清IgE ELISA 試劑盒、CK6、CK10、CK14、絲聚合蛋白、兜甲蛋白、刻度盤氏測厚儀、TewameterTM儀。

2 實驗方法

2.1 BALB/c脫毛 小鼠雙耳及周邊毛發(fā)均勻涂人用脫毛膏（購自日本株式會社Aquaverite）約1ml，作用5min后，用醫(yī)用棉簽蘸清水清洗干凈，小鼠放置適應(yīng)恢復(fù)3d，見圖1。

圖1 小鼠脫毛后

脫毛膏脫毛3d后的小鼠，未見炎癥反應(yīng)，與正常小鼠耳相似。

2.2 實驗分組 將BALA/c小鼠隨機分為8組：A正常組15只，B丙酮組15只，模型組75只，模型組造模2周后隨機分為C模型組15只，D空白基質(zhì)組、E空白基質(zhì)+透明質(zhì)酸組、F空白基質(zhì)+透明質(zhì)酸+馬齒莧組、G空白基質(zhì)+透明質(zhì)酸+青刺果油組、H空白基質(zhì)+透明質(zhì)酸+馬齒莧組+青刺果油組各12只。

2.3 BALB/c小鼠模型建立的方法 AD皮損誘導(dǎo)參考Hideki kitagaki[5]等和Eun-Ju Choi[6]等文獻并稍加改動。BALB/c小鼠雙耳和足墊應(yīng)用1%的DNCB各20ul致敏，以后每3d1%DNCB雙耳20ul，于第7日用1%的OX雙耳20ul加強致敏，連續(xù)6周。觀察皮損變化及搔抓情況，分別于治療前、治療1周、治療2周、治療3周和治療4周每組各處死3只小鼠，眼眶取血，鼠耳皮損剪除送組織病理，電鏡觀察，部分鼠耳皮損-80℃保存，標本全部收齊后待檢。

2.4 鼠耳厚度 采用刻度盤式測厚儀測量鼠耳厚度，統(tǒng)一同一部位測小鼠耳廓上緣，每3d測量一次。

2.5 血清總IgE水平測定 眼科鑷子眼眶取血后，迅速離心（3 000r/min，20min），取上層血清，立即-80℃凍存待檢。標本全部收齊后，應(yīng)用IgE ELISA Kit檢測血清總IgE水平，操作按試劑盒說明書進行，顯色終止后立即在酶標儀上測定吸光度（A450）值，制作標準曲線，按曲線換算樣品中IgE濃度。

2.6 組織病理HE染色 處死的鼠耳皮損1份，4%中性甲醛固定，皮損脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋、切片、脫蠟，蘇木精染色5min，伊紅染色1min，脫水、中性樹膠封片。

2.7 蛋白芯片分析炎癥因子 鼠耳皮損1份，d枰稱取約40ug，消毒眼科剪刀剪碎皮損，加入含PMSF400ul裂解液，低速電動研磨器冰上充分研磨，4℃離心（14 000r/min，15min），取上層清液，分光光度計測出樣本蛋白濃度，所有樣品蛋白濃度稀釋為同一濃度100ug/ml，應(yīng)用小鼠炎癥因子定量抗體芯片1分析樣品，操作按小鼠炎癥因子定量抗體芯片1說明書操作，操作完畢采用激光掃描儀Axon GenePix掃描信號，采用Cy3或者綠色通道（激發(fā)頻率=532nm），PMT=700；采用Genepix 4000B軟件提取熒光信號原始數(shù)據(jù)；采用RayBio QAM-INF-1的數(shù)據(jù)分析軟件來進行數(shù)據(jù)分析。

2.8 電鏡檢測板層小體 鼠耳朵皮損立即固定于1%戊二醛電鏡液內(nèi)，4℃保存待檢。標本收齊后送昆明醫(yī)科大學(xué)電鏡室觀察表皮顆粒層內(nèi)板層小體的變化。

2.9 免疫組化 ① 4%的甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、脫蠟；3%過氧化氫，室溫孵育10min；0.01%mol/L枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液，高壓法抗原修復(fù)5min；5%封閉用綿羊血清封閉30min；一抗，37°C孵育1h；二抗，37°C孵育30min。洗滌步驟：以PBS漂洗3次，每次5min。DAB顯色，脫水，封片。② 結(jié)果判斷。

2.10 無創(chuàng)性皮膚生理功能測定 ① 皮損水分含量和TEWL：分別于治療前、治療1周、治療2周、治療3周和治療4周測鼠耳皮損水分含量和TEWL，每組每次測10處皮損，所有的檢測均在室溫為（23～25）℃、濕度為50%～60%的室內(nèi)進行。② 采用Moisture Checker（日本SCALAR公司）測量皮損水含量；采用Tewameter TM儀（德國Courega+Khazaka公司）測量皮損 TEWL［單位：g/（cm2·h）］。

2.11 統(tǒng)計方法 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 17.0軟件包，計量資料用（）表示，行t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 鼠耳皮損情況 連續(xù)觀察6周，BALB/c鼠丙酮組雙耳和正常組無明顯變化，模型組雙耳1周后明顯增厚，出現(xiàn)紅斑、鱗屑及血痂，見圖2，小鼠出現(xiàn)搔抓。生物活性貼膜治療組治療4周后可見淡紅斑，無明顯的鱗屑及血痂，搔抓不明顯，H組尤其明顯，見圖2。

圖2 不同時間不同組小鼠皮損變化

圖2中的A、B、C分別表示正常組、丙酮組和模型組。模型鼠鼠耳出現(xiàn)明顯的紅斑、鱗屑和血痂。正常組和丙酮組無明顯變化，模型組可見明顯的紅斑、鱗屑及血痂，空白基質(zhì)組治療效果欠佳，生物活性貼膜治療組紅斑明顯變淡，鱗屑、結(jié)痂基本消退。14d、21d、28d、35d、42d分別代表治療前、治療1周、2周、3周和4周，D為空白基質(zhì)組，E為空白基質(zhì)+透明質(zhì)酸組，F(xiàn)為空白基質(zhì)+透明質(zhì)酸+馬齒莧組，G為空白基質(zhì)+透明質(zhì)酸+青刺果油組，H為空白基質(zhì)+透明質(zhì)酸+馬齒莧組+青刺果油組。

3.2 鼠耳厚度 模型組鼠耳厚度與正常組和丙酮組比較顯著增厚，治療組耳厚度明顯好轉(zhuǎn)，42d時H組與其他各組比較，P＜0.05。14d時模型組與正常組和對照組比較，*P＜0.05；21d、28d、35d、42d時基質(zhì)組與模型組比較，#P＞0.05；42d時H組與E、F、G組比較，##P＜0.05；42d時E、F、G、H組與C、D組比較，P＜0.05。見表1。

表1 不同時間不同組鼠耳厚度的比較（，mm）

表1 不同時間不同組鼠耳厚度的比較（，mm）

組別 14d 21d 28d 35d 42d A 組 29.60±1.17 29.70±1.06 29.40±0.97 30.00±1.05 29.83±0.75 B 組 30.30±1.34 30.10±1.37 30.30±0.95 30.10±1.37 29.67±0.82 C 組 59.7±4.35* 53.70±2.50 49.60±2.22 54.50±2.64 53.50±1.87 D 組 50.60±4.30# 45.90±2.30# 51.50±3.21# 52.50±1.05#E 組 48.60±2.95 44.30±2.83 49.40±3.86 50.33±0.82 F 組 47.10±3.03 42.60±2.12 46.30±3.59 49.33±1.21 G 組 47.60±2.07 43.20±2.57 44.70±2.95 47.17±1.47 H 組 46.20±3.94 42.80±2.25 45.10±2.51 44.50±1.87##

3.3 組織病理 HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察，正常組和丙酮組組織病理相差不大；經(jīng)1%DNCB和1%OX反復(fù)致敏的模型鼠耳組織特點為表皮增厚，真皮毛細血管擴張，可見中性粒細胞、淋巴細胞和少許嗜酸性粒細胞浸潤，見圖3。治療后表皮變薄，血管炎擴張減輕，炎癥浸潤明顯減少，H治療組尤其明顯。

圖3 不同時間不同組小鼠皮損組織病理變化（HE×40）

3.4 血清總IgE 產(chǎn)生IgE是AD的一個重要特點，應(yīng)用1%DNCB和1%OX反復(fù)致敏BALA/c鼠后引起鼠血清總IgE明顯升高，每組數(shù)據(jù)為處死的3只小鼠IgE的平均值。模型組鼠與正常組和丙酮組比較血清總IgE明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），正常組與丙酮組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具體見表2。42d時E、F、G、H組與C、D組兩兩比較，*P＜0.05；H組與E、F、G組比較，#P＜0.05。

表2 不同時相組別血清總IgE濃度比較（，IU/ml）

表2 不同時相組別血清總IgE濃度比較（，IU/ml）

組別 14d 21d 28d 35d 42d A 組 135.5±4.90 151.10±8.00 128.10±9.59 127.50±8.66 140.20±6.78 B 組 148.3±6.06 127.60±3.42 140.70±5.98 119.80±9.31 138.10±4.10 C 組 209.3±6.72 210.90±9.43 197.70±7.26 193.70±5.17 194.30±5.29 D 組 214.38±10.16 224.70±7.73 176.41±4.14 126.46±5.21 E 組 197.21±6.17 168.60±5.06 136.23±10.84 198.52±5.37*F 組 193.30±6.75 187.41±5.71 169.55±7.93 181.28±12.55*G 組 206.38±7.02 200.45±10.11 159.41±5.94 135.34±4.99*H 組 176.44±5.90 176.55±7.53 116.89±7.62 78.28±5.92*#

3.5 炎癥因子 小鼠炎癥因子定量抗體芯片1結(jié)果圖像見圖4，每個樣品的一個炎癥因子有4個熒光信號。小鼠炎癥因子定量抗體芯片1檢測造模14d，治療后2周、44周時皮損內(nèi)IL-4、IL-5、IL-13、IL-12、IFN-r。應(yīng)用Genepix 4000B軟件提取熒光信號原始數(shù)據(jù)，每個樣品為4個熒光信號數(shù)據(jù)值。造模14d時IL-4、IL-5、IL-13的4個熒光信號數(shù)值，模型組與正常組、丙酮組比較，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而IL-12、IFN-r比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3；治療2周時IL-4、1L-5、IL-13的熒光信號數(shù)值治療組與基質(zhì)組、模型組比較，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而IL-12、IFN-r比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4；治療4周時IL-4、1L-5、IL-13、IL-12、IFN-r的熒光信號數(shù)值，治療組與模型組比較，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而IL-12、IFN-r治療組與丙酮組比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表5。每個樣品的4個信號數(shù)據(jù)值，采用RayBio QAM-INF-1的數(shù)據(jù)分析軟件計算出樣品的濃度（4個信號的平均值）并繪制成柱狀圖，見圖5。從柱狀圖中可看到，造模14d時模型組IL-4、IL-5、IL-13含量增多，IL-12、IFN-r含量減少；治療后2周和4周皮損中IL-4、IL-5、IL-13含量減少，IL-12、IFN-r含量增加。

圖4 小鼠炎癥因子定量抗體芯片1結(jié)果圖像

圖5 不同時間不同組小鼠皮損炎癥因子的濃度（pg/ml）

表3 造模14d時不同組別炎癥因子熒光信號值比較（，n=4）

表3 造模14d時不同組別炎癥因子熒光信號值比較（，n=4）

注：*P示模型組與正常組比較的P值；#P示模型組與丙酮組比較的P值。

組別與P值 IL-4 IL-5 IL-13 IL-12 IFN-r正常組 303.00±20.23 166.75±16.50 6.25±3.02 45.75±2.99 140.25±38.79丙酮組 364.00±47.00 143.75±2.63 4.75±1.26 48.00±4.69 115.75±9.29模型組 505.00±63.34 217.25±4.80 16.50±5.45 39.75±4.03 142.50±38.07*P 0.000 0.025 0.04 0.061 0.923#P 0.002 0.004 0.02 0.016 0.265

表4 治療2周后不同組別炎癥因子熒光信號值比較（，n=4）

表4 治療2周后不同組別炎癥因子熒光信號值比較（，n=4）

組別 IL-4 IL-5 IL-13 IL-12 IFN-r A 組 303.50±13.40 163.25±10.28 6.75±0.96 44.50±3.51 140.75±36.92 B 組 339.50±17.60 156.75±7.54 5.25±0.98 45.75±2.75 163.50±36.24 C 組 484.75±44.19 207.50±7.59 23.25±2.22 38.50±7.14 143.25±19.50*#★D 組 409.25±32.37 140.75±14.36 11.50±3.11 39.50±2.38 150.75±12.69*#★E 組 365.00±21.37 183.75±10.81 8.00±1.83 42.00±0.82 169.15±22.61 F 組 383.00±11.30 231.50±44.30 5.75±1.26 43.50±6.14 162.25±39.13 G 組 404.25±12.30 252.75±29.90 7.25±1.50 39.25±4.79 184.00±11.34 H 組 355.00±11.40 190.52±5.70 6.25±2.22 40.00±2.92 159.25±27.62

表5 治療4周后不同組別炎癥因子熒光信號值比較（，n=4）

表5 治療4周后不同組別炎癥因子熒光信號值比較（，n=4）

組別 IL-4 IL-5 IL-13 IL-12 IFN-r A 組 313.00±20.23 165.50±11.79 7.75±0.96 46.50±2.65 175.50±10.66 B 組 301.75±16.13 157.00±7.62 9.00±2.16 44.50±3.00 176.75±18.23 C 組 564.50±18.43 258.00±39.03 25.00±4.97 37.50±7.14 136.50±7.94*#★D 組 403.75±52.92 237.50±4.65 21.75±2.99 42.25±2.22 146.50±23.81*#★E 組 425.25±48.66 237.00±14.77 17.25±1.89 45.50±3.31 156.75±14.91 F 組 341.15±38.34 240.00±14.02 18.23±2.65 44.25±3.30 173.59±8.79 G 組 429.50±36.66 232.75±12.00 15.33±3.23 42.75±5.32 161.75±11.16 H 組 325.25±28.66 217.59±9.02 13.11±3.37 43.75±2.87 186.75±12.89

E、F、G、H 組 IL-4與 C、D 組比較，*P＜ 0.05；E、F、G、H組間比較，P＞0.05；E、F、G、H組IL-5與C、D組比較，#P＜0.05，組間H與E、F、G組間比較P＜0.05。IL-13E、F、G、H與C、D組比較，★P＜0.05，E、F、G、H組間比較，P＞0.05。A、B、C、D、E、F、G組IL-12比較，P＞0.05。A、B、C、D、E、F、G組IFN-r比較，P＞0.05。

E、F、G、H組IL-4與C、D組比較，*P＜0.05，E組與F、G、H組間比較，P＜0.05。E、F、G、H組IL-5與C、D組比較，#P＜0.05，組間H與E、F、G組間比較，P＜0.05。E、F、G、H組IL-13與C、D組比較，★P＜0.05，H組與E、F、G組間比較，P＞0.05。A、B、C、D、E、F、G組IL-12比 較，P＞0.05。E、F、G、H組 IFN-r與 C、D 組比較，P＜0.05，H組與F、G、H組比較，P＜0.05。

14d時模型組IL-4、IL-5、IL-13濃度明顯升高，IL-12、IFN-r濃度降低；治療2周和4周后治療組和基質(zhì)組的IL-4、IL-5、IL-13濃度明顯降低，IL-12、IFN-r濃度升高，H治療組效果明顯。

3.6 板層小體檢測 板層小體合成、分泌神經(jīng)酰胺等細胞間脂質(zhì)成分，數(shù)量及功能決定細胞間脂質(zhì)含量。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組的板層小體腫脹，明顯減少，而治療組板層小體腫脹減輕，數(shù)量增多，H組尤其明顯，見圖6。A正常組和B丙酮組可見密集的板層小體；模型組部分板層小體出現(xiàn)水腫；治療后水腫的板層小體水腫減輕、減少。

圖6 不同時間不同組小鼠皮損LB變化（HE×30 000）

3.7 免疫組化 42d時免疫組化，正常小鼠filaggrin免疫組化染色主要表達在顆粒層上方，模型組染色增寬，染色強度減弱，治療組由于顆粒層變薄，染色寬度較模型組窄，染色強度增強；正常小鼠loricrin免疫組化染色局限在顆粒層上方，模型組loricrin數(shù)量增加，染色擴展為整個顆粒層，顏色的厚度增加，治療組厚度染色主要在顆粒層，淡染色顏色較模型組變淡；正常小鼠耳K6不表達，模型組表達在整個基底層。治療由于皮膚厚度變薄，表達較模型組窄2倍，染色減弱；K10染色在基底層和基底層上方，模型組K10染色都集中在顆粒和上尖尖的層,淡染色變淡，治療組得到改善；正常小鼠耳K14表達在基底層和基底層上方，模型組表達在整個增寬的表皮層，治療組表達在基底層，見圖7。

圖7 42d時不同組小鼠皮損免疫組化情況

3.8 無創(chuàng)性皮膚生理功能 皮膚屏障功能遭到破壞后，表皮內(nèi)的水分會經(jīng)過角質(zhì)層丟失，使皮膚變得干燥，從而加重某些皮膚病。不同時相組別鼠耳TEWL以及水分含量的比較見表6、表7。

表6 不同時相組別鼠耳TEWL的比較［，g/（cm2·h）］

表6 不同時相組別鼠耳TEWL的比較［，g/（cm2·h）］

注：42d時C組與A、B組比較，*P＜ 0.05；E、F、G、H組與 C、D組比較，#P ＜0.05；42d時 H組與 E、F、G組比較，##P＜0.05。

組別 14d 21d 28d 35d 42d A 組 7.85±1.06 7.88±1.34 7.98±1.03 8.48±1.03 7.27±0.90*B 組 8.12±0.91 8.60±2.03 8.50±1.10 8.55±1.74 7.82±0.64*C 組 34.93±5.23 28.41±6.71 30.07±4.27 33.58±5.39 31.30±4.61#D 組 20.34±2.76 29.24±3.35 31.25±3.29 30.22±1.72#E 組 19.78±4.63 26.58±5.96 28.39±2.65 31.78±3.14 F 組 19.50±2.35 30.38±5.36 29.83±3.60 24.82±2.82 G 組 18.24±2.50 28.74±3.25 30.72±2.41 22.40±2.39 H 組 16.18±3.10 29.55±4.25 26.42±1.91 17.62±2.74##

表7 不同時相組別鼠耳水分含量的比較（，%）

表7 不同時相組別鼠耳水分含量的比較（，%）

注：42dD、E、F、J、H 組與 C 組比較，*P ＜ 0.05。

組別 14d 21d 28d 35d 42d A 組 29.50±2.15 27.33±2.09 27.92±2.52 29.82±1.43 28.87±1.07 B 組 28.42±1.52 29.42±1.41 27.23±2.24 30.81±1.73 29.08±1.32 C 組 25.89±4.37 29.87±2.22 31.33±0.51 28.93±2.82 29.03±2.12*D 組 32.86±1.86 32.19±1.77 32.01±1.16 31.65±1.08 E 組 29.96±1.45 32.36±1.28 32.93±1.76 30.48±0.65 F 組 32.96±2.28 31.78±1.96 31.89±2.07 31.40±1.08 G 組 31.21±1.66 31.87±1.10 33.25±1.82 32.05±1.65 H 組 32.42±1.76 32.58±1.04 33.29±1.06 31.68±0.92

4 討論

特應(yīng)性皮炎是一種慢性、容易反復(fù)、以瘙癢為主要特征的炎癥性皮膚病，其病因及發(fā)病機制不清，目前主要認為是遺傳因素、免疫因素及皮膚屏障破壞等因素相互作用而致[14]。新的觀點認為免疫調(diào)節(jié)失衡和皮膚結(jié)構(gòu)異常是AD發(fā)病的主要機制，因此恢復(fù)皮膚屏障功能并調(diào)節(jié)免疫失衡是治療AD的關(guān)鍵；研究結(jié)果顯示，早期干預(yù)可以改善皮損的嚴重程度并緩解其他靶器官受損情況，比如哮喘等[15]。因此本課題主要探討含有透明質(zhì)酸、馬齒莧及青刺果油的復(fù)合劑對BALB/c小鼠AD模型炎癥反應(yīng)的抑制作用和對皮膚屏障恢復(fù)作用[16]。

研究結(jié)果顯示，AD是以Th2為主導(dǎo)的炎癥浸潤，伴血清總IgE升高[17]。Th2細胞分泌產(chǎn)生高水平的 IL-4、IL-5、IL-13，而 IFN-r則明顯降低[18]。本實驗研究顯示經(jīng)生物活性敷料治療后，治療組的鼠耳皮損可見淡紅斑，未見結(jié)痂和血痂，耳廓厚度下降，組織病理改變提示，表皮變薄，炎性細胞浸潤減少，真皮血管擴張減輕。血清IgE濃度明顯較模型組降低，炎性細胞因子IL-4、IL-5、IL-13較模型組降低，而IL-12、IFN-r升高。表明含透明質(zhì)酸、馬齒莧、青刺果油的復(fù)合劑可有效抑制BALB/c鼠AD模型的炎癥反應(yīng)。

表皮最重要的功能是保護和防御功能，其中最關(guān)鍵的是角質(zhì)層的滲透屏障功能，可阻止水分的蒸發(fā)。表皮最外層為角質(zhì)層，在角質(zhì)細胞的周圍含有豐富的細胞外脂質(zhì)，主要包括神經(jīng)酰胺、膽固醇和游離脂肪酸（FFA）。這些表皮脂質(zhì)及其前體是由角質(zhì)形成細胞的板層小體（LB）分泌而來[19]。板層小體對于維持正常皮膚屏障功能起到重要作用[20]。研究結(jié)果表明，屏障功能受損皮膚中板層小體的數(shù)量及脂質(zhì)合成明顯減少，通過治療恢復(fù)皮膚屏障功能后板層小體的結(jié)構(gòu)、數(shù)量及分泌功能趨于正常[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，AD模型組小鼠表皮角質(zhì)形成細胞中的板層小體出現(xiàn)水腫且數(shù)量明顯減少，而含透明質(zhì)酸、馬齒莧、青刺果油的復(fù)合劑治療組板層小體水腫明顯減少，數(shù)量明顯增多[22-25]。前期研究結(jié)果曾顯示，青刺果油具有促進透明質(zhì)酸及神經(jīng)酰胺合成和分泌的作用，可能與其改善板層小體結(jié)構(gòu)及功能有關(guān)，從而使皮膚屏障功能恢復(fù)，TEWL降低。

TEWL是皮膚屏障功能主要的評價指標，通過測定皮膚表面的水蒸氣壓梯度表明水分散失的情況，反映了皮膚的水通透屏障。當屏障功能受損時，TEWL值增高，當屏障功能得到修復(fù)，TEWL值逐漸恢復(fù)正常[26]。越來越多的研究者通過測量TEWL來研究疾病的發(fā)病機制和藥物研究開發(fā)，并證實TEWL測量能夠評估犬或鼠皮膚屏障功能[25-28]。本研究中，與正常小鼠相比，AD模型小鼠TEML表明升高，而含透明質(zhì)酸、馬齒莧及青刺果油的復(fù)合劑治療組小鼠TEWL則明顯降低，提示其皮膚屏障功能恢復(fù)。

角質(zhì)細胞膜中間絲相關(guān)蛋白（FLG）Loricrin和Involucrin的交叉鏈接，構(gòu)成了表皮的滲透性屏障。中間絲相關(guān)蛋白（FLG）是表皮屏障的關(guān)鍵點，研究表明FLG突變是AD的發(fā)病機制之一，并與其嚴重性密切相關(guān)。AD患者皮損中FLG的表達及其免疫組化染色強度明顯減弱。在本研究中使用含有透明質(zhì)酸、馬齒莧及青刺果油的復(fù)合劑治療AD樣小鼠后，取皮膚行免疫組化染色，結(jié)果顯示，正常小鼠皮膚Filaggrin免疫組化染色主要表達在角質(zhì)層，AD模型組中FLG陽性細胞層數(shù)增加但染色強度明顯減弱，而含有透明質(zhì)酸、馬齒莧及青刺果油的復(fù)合劑治療組中小鼠皮膚的FLG表達明顯增強。LOR是角化套膜中的一個組件，其主要作用是增強角化套膜結(jié)構(gòu)的主要強化蛋白質(zhì)[22]。正常小鼠Loricrin位于顆粒層角質(zhì)形成細胞中，而AD模型組中Loricrin陽性細胞數(shù)量及免疫組化染色強度明顯增加，治療組中Loricrin表達及染色強度與正常皮膚相似。正常情況下，表皮角質(zhì)形成細胞不表達K6，K14表達于具有增殖活力的角質(zhì)形成細胞中，而K10表達于基底層以上的細胞中。AD模型組中K6表達于基底層以上各層角質(zhì)形成細胞，且染色強度明顯增強，K10及K14陽性細胞層數(shù)增加且染色強度增強，這與之前報道的人異位性皮炎皮損免疫組化染色結(jié)果相一致。在含有透明質(zhì)酸、馬齒莧及青刺果油的復(fù)合劑治療組中小鼠表皮K6、K10及K14的表達恢復(fù)正常，與正常小鼠相似。結(jié)果提示，該外用貼膜通過促進角質(zhì)形成細胞的增殖與分化之間的平衡而調(diào)節(jié)表皮的新陳代謝。

綜上所述，含透明質(zhì)酸、馬齒莧及青刺果油的復(fù)合劑通過抑制IgE產(chǎn)生，平衡炎性介質(zhì)產(chǎn)生及角質(zhì)形成細胞的增殖與分化，恢復(fù)板層小體的結(jié)構(gòu)及功能，從而有效地抑制BALB/c小鼠AD模型的炎癥反應(yīng)并恢復(fù)其皮膚屏障功能，為臨床治療AD提供了一種新的方法。