蒲 波，余才鋒，孫 锎

（重慶三峽中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，重慶 404000）

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，死亡人數(shù)占全球癌癥死亡患者的18.4%，位居癌癥死亡人數(shù)的第一位[1]。近60%的肺癌在初診時即為轉移性[2]。肺癌患者5年存活率仍低于5%[2]，因此尋找肺癌的有效治療手段仍是近些年研究的熱點。

γδT細胞代表T細胞的一個特殊亞群，其細胞識別相關抗原不具有主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性，被認為是連接先天和適應性免疫反應的橋梁[3-4]。γδT細胞根據(jù)表面分子表達可分為Vγ9Vδ1 T細胞（主要分布于上皮相關的淋巴組織）和Vγ9Vδ2 T細胞（主要分布于外周血）亞群[5-6]。其中Vγ9Vδ2 T細胞以殺傷功能為主，在抗腫瘤免疫和防止病原體入侵方面有重要的作用，在腫瘤免疫治療中展現(xiàn)出良好的潛力[7-10]。程序化死亡分子（programmed death-1，PD-1）是一種免疫負調節(jié)分子，與其配體PD-L1相互作用，對機體的免疫功能發(fā)揮抑制作用。多項研究[11-13]已證實，PD-1分子在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中有重要的作用，多種針對PD-1的單克隆抗體已被用于治療肺癌[14-15]。關于Vγ9Vδ2 T細胞對肺癌細胞的殺傷情況及PD-1對Vγ9Vδ2 T細胞的調節(jié)機制鮮有報道。本文分離肺癌患者外周血Vγ9Vδ2 T細胞并體外擴增，觀察對肺癌細胞的殺傷情況，探討PD-1對Vγ9Vδ2 T細胞殺傷功能的影響及相關機制，以期為肺癌患者Vγ9Vδ2 T細胞免疫療法的應用提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集重慶三峽中心醫(yī)院2019年1月至12月經病理診斷為肺癌的患者共20例，其中男性15例，女性5例。所有患者術前均未接受化療和放療?；颊吣挲g46~80歲，平均（60.15±10.42）歲。所有患者均知情同意，本研究經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分離

無菌抽取肺癌患者外周靜脈血5 mL，在無菌環(huán)境中轉入15 mL無菌離心管中，加入5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）稀釋后混勻。于50 mL離心管中加入5 mL的淋巴細胞分離液（Biolegend公司），然后將稀釋的血液緩慢沿離心管壁加到淋巴細胞分離液的上層，800×g離心20 min后，吸取上層血清和下層淋巴細胞分離液中間的白膜層，加入裝有10 mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基的50 mL離心管中，混勻后400×g離心10 min；棄上清，再加入培養(yǎng)液重復上述操作；最后用1 mL含10%胎牛血清（Gibco公司）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基將細胞沉淀重懸，臺盼藍染色計數(shù)后制備成濃度為2×106個/mL的細胞懸液。

1.3 γδT細胞擴增方法

anti-pan-TCRγδmAb抗體（Beckman公司）包被。取干凈無菌的24孔板一個，于24孔板的2個孔中每孔加入10μL anti-pan-TCRγδmAb（0.05 mg·mL-1）及500μL RPMI-1640培養(yǎng)基；將24孔板置于37°C孵箱孵育2 h；取出24孔板，棄去孔中液體，于孔中加入制備好的上述PBMC懸液2 mL，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第5天，棄去舊培養(yǎng)基，采用PBS緩沖液洗滌2遍，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；待培養(yǎng)至第14天時收集擴增的γδT細胞，采用流式細胞儀分析純度及細胞亞型。

1.4 流式細胞術

固相化抗體擴增后的細胞以含1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA；Sigma公司）的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS；Hyclone公司）；洗滌2次后，加入相應熒光抗體（PE-anti-CD3抗體和FITC-anti-TCRγδ抗體/PE-anti-CD3抗體和FITC-anti-Vδ1抗體/PEanti-CD3抗體和FITC-anti-Vδ2抗體/PE-anti-CD3抗體和FITC-anti-Vδ2抗體以及APC-anti-PD-1）（Biolegend公司），4℃避光孵育30 min；以含1%BSA的PBS洗滌2次后，細胞重懸于0.1 mL 1%多聚甲醛固定液中待流式細胞儀檢測。

1.5 Vγ9Vδ2 T細胞殺傷功能檢測

采用CytoTox 96R非放射性細胞殺傷檢測試劑盒（Promega公司）定量測量乳酸脫氫酶（LDH）。具體方法[16]：Vγ9Vδ2 T細胞和肺癌細胞系分別按10∶1、20∶1和40∶1的比例進行共培養(yǎng)。37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h后，吸取50μL培養(yǎng)上清轉移到酶分析板中，向酶分析板中加入檢測緩沖液（50μL/孔），蓋好平板，室溫避光孵育30 min，向每孔中加入50μL終止液，在590 nm記錄吸光值，根據(jù)吸光值作標準曲線評估細胞殺傷能力。

1.6 Vγ9Vδ2 T細胞殺傷封閉實驗

采用CytoTox 96R非放射性細胞殺傷檢測試劑盒，分析阻斷Fas/FasL途徑和PD-1/PD-L1途徑對細胞殺傷的封閉作用。穿孔素-顆粒酶途徑封閉實驗中，在37°C條件下，采用100 nmol·L-1穿孔素/顆粒酶途徑的阻斷劑（CMA）（Sigma公司）預處理Vγ9Vδ2 T細胞1 h；在37°C條件下，分別采用FasL（Biolegend公司）中和抗體和PDL1（Santa Cruz公司）中和抗體封閉Vγ9Vδ2 T細胞中FasL和PD-L1 1 h。之后按照1.5實驗步驟進行操作。

1.7 細胞脫顆粒情況檢測

Vγ9Vδ2 T細胞和肺癌細胞系NCI-H446細胞按照效靶比40∶1的比例混合置于24孔板中，24孔板離心使細胞沉淀于底部充分接觸，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱孵育6 h。隨后收取細胞置于15 mL離心管中離心，加入1 mL含1%BSA的PBS洗滌液重懸于eppendorf管中，充分混勻后250×g離心8 min，棄上清。細胞沉淀以0.1 mL含1%BSA的PBS重懸，于液體中加入FITC-anti-TCRVδ2抗體（Biolegend公司）和PE-anti-CD107a抗體（Biolegend公司）進行孵育，流式細胞儀進行檢測，分析CD107a陽性的細胞占總殺傷細胞的比例，評價其脫顆粒能力。其中，TCRVδ2為Vγ9Vδ2 T細胞表面標記，而CD107a為脫顆粒細胞的標記物。

1.8 Vγ9Vδ2 T細胞裂解性顆粒極化情況檢測

分別將Vγ9Vδ2 T細胞和肺癌細胞NCI-H446懸液稀釋至1×107個/mL。取Vγ9Vδ2 T細胞和肺癌細胞NCI-H446懸液各100μL混勻，20×g離心3 min；37°C、5%CO2培養(yǎng)箱孵育20 min；混合細胞轉入poly-D-lysine包被的2孔細胞培養(yǎng)板（購自BD Biosciences公司）中，室溫孵育1 h；棄去培養(yǎng)基，1 mL PBS洗2次；4%多聚甲醛1 mL室溫固定20 min；1 mL PBS洗2次；0.5 mL透化緩沖液室溫處理細胞30 min；加入含3μg·mL-1穿孔素抗體的染色Buffer室溫染色1 h；1 mL PBS洗3次，每次5 min；將片子于空氣中吹干；采用Pro－Long Gold Antifade Reagent封片，在激光共聚焦下隨機分析100個細胞，根據(jù)Vγ9Vδ2 T與肺癌細胞形成的突觸數(shù)量，判斷細胞極化情況。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，三組間比較使用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體外擴增肺癌患者外周血γδT細胞比例及亞型分析

流式細胞術檢測肺癌患者外周血初始分離情況下γδT細胞比例為（3.53±2.21）%；采用anti-pan-TCRγδmAb固相化擴增14 d后，γδT細胞比例可增加至（82.5±13.4）%（P＜0.01）。擴增的γδT細胞中Vγ9Vδ1 T細胞比例為（42.4±7.92）%，Vγ9Vδ2 T細胞比例為（40.1±8.51）%。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測肺癌患者外周血γδT細胞比例及亞型

2.2 Vγ9Vδ2 T細胞對肺癌細胞系的細胞毒作用

對3例肺癌患者外周血擴增的γδT細胞進行流式分選，以獲取純度＞90%的Vγ9Vδ2 T細胞用于殺傷實驗。與對照組相比（單純肺癌細胞），體外擴增的肺癌患者外周血Vγ9Vδ2 T細胞對NCI-H446細胞和A549細胞均具有殺傷效果（P均＜0.05）。見表1。

表1 Vγ9Vδ2 T細胞對肺癌細胞系的細胞毒作用（%）

2.3 體外擴增Vγ9Vδ2 T細胞表面PD-1表達分析及其對Vγ9Vδ2 T細胞殺傷功能的影響

體外擴增肺癌患者外周血Vγ9Vδ2 T細胞表面均存在不同程度的PD-1表達。采用PD-L1封閉抗體封閉NIC-H446細胞和A549細胞表面PD-L1作用后，Vγ9Vδ2 T對肺癌細胞的殺傷能力增強［NCI-H446細胞：（35.24±4.12）%vs.（20.04±2.85）%；A549細胞：（20.14±1.95）%vs.（13.21±1.74）%］（P均＜0.01）。見圖2。

圖2 Vγ9Vδ2 T細胞表面PD-1表達分析及其對Vγ9Vδ2 T細胞殺傷功能的影響

2.4 Vγ9Vδ2 T細胞對肺癌細胞的殺傷作用主要依賴于穿孔素-顆粒酶途徑

采用穿孔素-顆粒酶途徑抑制劑CMA處理Vγ9Vδ2 T細胞后，Vγ9Vδ2 T細胞對NCI-H446細胞和A549細胞的殺傷作用均降低（P均＜0.01）；而采用FasL中和抗體封閉Fas-FasL途徑后，Vγ9Vδ2 T細胞對NCI-H446細胞和A549細胞的殺傷作用無變化（P均＞0.05）。見圖3。

圖3 穿孔素-顆粒酶途徑在Vγ9Vδ2 T細胞殺傷功能中具有重要作用

2.5 阻斷PD-1可增加Vγ9Vδ2 T細胞裂解性顆粒極化

流式細胞染色結果顯示，阻斷PD-1作用后，Vγ9Vδ2 T細胞脫顆粒方面能力無變化（P＞0.05）。激光共聚焦實驗結果顯示，阻斷PD-1作用后，Vγ9Vδ2 T細胞與肺癌細胞間的突出增多（P＜0.01）。見圖4。

圖4 Vγ9Vδ2 T細胞脫顆粒及裂解性顆粒極化情況檢測

3 討論

本研究結果顯示，采用anti-pan-TCRγδmAb固相化擴增肺癌患者PMBC 14 d后，γδT細胞純度可達80%以上，其中Vγ9Vδ2 T細胞比例和Vγ9Vδ1 T細胞比例相似，各占一半。前期已有研究證實[16]，健康人PMBC經14 d擴增后，γδT細胞純度也可達80%以上，但其中主要為Vγ9Vδ2 T細胞，可占80%左右，僅有一小部分為Vγ9Vδ1 T細胞（比例＜10%）。健康人和肺癌患者外周血擴增γδT細胞亞型的不同，推測可能與肺癌患者Vγ9Vδ1 T細胞的免疫抑制功能有關，從而抑制了Vγ9Vδ2 T細胞的增殖。已有研究[17-19]證實，Vγ9Vδ1 T細胞與多種腫瘤的免疫逃逸有關，且Peng等[20]研究結果顯示，在乳腺癌患者外周血擴增的γδT細胞中Vγ9Vδ1 T細胞比例也增加。

流式細胞術結果顯示，體外擴增肺癌患者外周血Vγ9Vδ2 T細胞表面均存在不同程度的PD-1表達，在阻斷PD-1作用后Vγ9Vδ2 T細胞對肺癌細胞的殺傷能力增強。已有大量研究[11-13]發(fā)現(xiàn)PD-1的表達與殺傷性T細胞的殺傷功能抑制有關，且已證實PD-1分子在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。PD-1抑制劑的出現(xiàn)改善了晚期肺癌患者的前景[14-15]。2015年以來，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準多種PD-1抑制劑用于肺癌的一線和二線治療。

PD-1抑制劑可聯(lián)合化療、放療或小分子抑制劑等聯(lián)合療法治療肺癌[21-24]。目前臨床還未見PD-1抑制劑聯(lián)合過繼免疫治療的研究進展。本研究從基礎研究角度闡釋PD-1抑制Vγ9Vδ2 T細胞殺傷功能的機制，證明Vγ9Vδ2 T細胞殺傷肺癌細胞的主要途徑是穿孔素-顆粒酶。Vγ9Vδ2 T細胞通過穿孔素-顆粒酶途徑殺傷靶細胞需要脫顆粒和裂解性顆粒極化兩個步驟[25]。顆粒酶和穿孔素存在于細胞的胞漿顆粒中，活化的Vγ9Vδ2 T細胞將顆粒酶和穿孔素釋放進入細胞間隙。穿孔素可以在細胞膜上形成孔道，增加細胞膜通透性，引發(fā)靶細胞裂解。另外，穿孔素還引起裂解性顆粒極化，在細胞質、胞漿和細胞核重新分布，使顆粒酶聚集在裂解部分，促進靶細胞裂解[26]。流式細胞術結果顯示阻斷PD-1作用后，Vγ9Vδ2 T細胞脫顆粒方面能力并未增加，而裂解性顆粒極化水平增加。說明PD-1主要是通過抑制Vγ9Vδ2 T細胞裂解性顆粒極化從而抑制Vγ9Vδ2 T細胞對肺癌細胞的殺傷能力。然而，本研究仍存在一定的不足，如未對PD-1抑制Vγ9Vδ2 T細胞的裂解性顆粒極化的信號機制開展進一步的研究。因此，進一步的信號機制研究也是未來關注的重點。

綜上所述，肺癌患者外周血擴增Vγ9Vδ2 T細胞在體外對肺癌細胞具有殺傷作用，且主要依賴于裂解性顆粒的極化；而PD-1抑制肺癌患者外周血擴增Vγ9Vδ2 T細胞的殺傷作用主要通過抑制裂解性顆粒極化而實現(xiàn)，為闡明肺癌患者外周血擴增Vγ9Vδ2 T細胞殺傷肺癌細胞的作用機制提供了一定的證據(jù)支持。