韓忝甫 范懿慶 張立勛 范為正

（江南大學 藥學院,江蘇 無錫214122）

KRASG12C抑制劑ARS-1620,化學名為1 -[4 -[（7S）-6 -氯-8 -氟-7 -（2 -氟-6 -羥基苯基）-4 -喹唑啉基] -1 -哌嗪基] -2 -丙烯酮,是由美國亞歷克西斯制藥公司與強生集團旗下的楊森公司共同研發(fā)的KRASG12C別構共價抑制劑[1],該抑制劑可與KRASG12C上的別構區(qū)域（S-IIP）附近內的半胱氨酸位點發(fā)生共價結合[2],保持KRAS-GDP 結合狀態(tài),使其不能轉化為KRAS-GTP 結合的活性狀態(tài),使得異常激活的KRASG12C得以失活,從而抑制下游通路,最終控制腫瘤細胞的惡性增殖與分化[3]。KRAS 突變是RAS 突變中的一類,在胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）中達97%,其次為結直腸癌、多發(fā)性骨髓瘤和肺癌,分別為52%、42% 和32%[4],大約30%的惡性腫瘤與RAS 基因突變有關,KRAS 突變約占其中的85%,而其中大約44% 的KRAS 突變?yōu)榈谑坏母拾彼幔℅）被半胱氨酸（C）所取代,產(chǎn)生KRASG12C突變[5]。目前臨床上還未有直接針對KRASG12C突變的小分子抑制劑,無法給KRASG12C患者帶來積極的臨床獲益。而其他間接抑制KRASG12C的抑制劑,比如:KRAS 翻譯后修飾的相關酶的抑制劑（法尼基酶抑制劑等）在臨床中也未展現(xiàn)良好的效果[6],而抗PD-1/PD-L1 療法對他們的療效也非常有限[7],所以KRASG12C突變引發(fā)的癌癥一直缺乏有效的靶向化療方案。目前有幾種KRASG12C共價別構抑制劑已經(jīng)進入臨床階段比如:Adagrasib、Sotorasib 等[8-9],而ARS -1620 作為研究KRASG12C共價別構抑制劑的工具化合物,科研人員可通過該化合物去影響KRASG12C突變蛋白,進而觀察分子水平、細胞水平以及動物模型水平的生命過程中的生理病理過程,對于理解KRASG12C介導的癌癥發(fā)生的機制,揭示KRASG12C介導的癌癥發(fā)生發(fā)展過程,具有重要作用。另外在藥物研發(fā)過程中,該化合物也可作為陽性對照品使用,本文作者對ARS -1620 的合成方法進行了研究,以期為該工具化合物的合成以及結構類似物的研究提供理論參考。

目前,只有原研公司的文獻報道了ARS -1620的合成路線[10]（圖1）:以2 -氨基-4 -溴-5 -氟苯甲酸4 為起始原料,在70 ℃條件下以N,N -二甲基甲酰胺為溶劑,與N -氯代琥珀酰亞胺發(fā)生SNAr 取代反應,之后將反應液加入攪拌的冰水中,得到氯代產(chǎn)物5；隨后以甲醇為溶劑,在回流溫度下,氯代產(chǎn)物5 與醋酸甲脒環(huán)合得到環(huán)合產(chǎn)物6,完成喹唑啉母核結構的合成。隨后,以二氯亞砜為溶劑,回流溫度下,中間體6 通過氯代得到氯代產(chǎn)物7；隨后以1,4 -二氧六環(huán)為溶劑,在N,N -二異丙基乙胺催化下,氯代產(chǎn)物7 與N-叔丁氧羰基哌嗪發(fā)生SNAr 取代反應得到中間體8；之后中間體8 與中間體9 經(jīng)過鈴木偶聯(lián)得到偶聯(lián)產(chǎn)物10,偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)過三氟醋酸脫掉Boc保護基,隨后與丙烯酰氯縮合后,再經(jīng)堿水解得到外消旋體11,外消旋體11 經(jīng)過手性柱色譜分離得到終產(chǎn)物12 即ARS-1620。

圖1 ARS-1620 的合成路線1[10]Fig．1 Synthetic route 1 of ARS-1620[10]

原研專利的合成路線步驟為六步反應,但其合成起始原料相對較為昂貴且不易得到,這增加了工藝成本。本工藝路線采用更加廉價的3 -溴-2 -氟苯胺為起始原料經(jīng)過三步反應得到原研路線中的起始原料4,避免了柱層析純化。另外中間體6合成后的純化采用石油醚∶乙酸乙酯=10 ∶1 為溶劑,在室溫下打漿2 ～3 小時,抽濾后干燥得到化合物6,節(jié)約了時間成本與溶劑。原研路線在制備化合物7 時,選擇飽和碳酸氫鈉打漿、抽濾的方式除去殘留的二氯亞砜。在制備化合物11 時,本文路線采用鹽酸-甲醇溶液體系進行脫Boc 保護基,在保證收率的同時使得操作更加簡便,改進后的工藝路線總收率由原來19．65%的提升至33%。改進后的工藝路線如圖2 所示。

圖2 ARS-1620 的合成路線2Fig．2 Synthetic route 2 of ARS-1620

1 實驗部分

1．1 主要儀器與試劑

LCMS-80 質譜儀（日本島津公司）；LC1260 色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Bruker AVIII-400MHz核磁共振儀（TMS 為內標）；低溫恒溫攪拌反應浴（鄭州科泰實驗設備有限公司）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州科泰實驗設備有限公司）；紫外線分析儀（鄭州科泰實驗設備有限公司）。

實驗所用試劑均為市售分析純或化學純,未進一步純化。

1．2 實驗步驟

1．2．1 化合物3 的合成

將水合氯醛（31．31 g, 189．36 mmol）與無水硫酸鈉（202．39 g,1424．9 mmol）攪拌下溶于60℃水（720 mL）中,加入3-溴-2-氟苯胺（30 g,157．8 mmol）攪拌30 min 后,依次加入濃鹽酸（60 mL）與鹽酸羥胺（43．97 g,632．77 mmol）置于90 ℃下反應6 h。將反應體系冷至室溫,過濾、濾餅用少量水洗兩次,乙酸乙酯打漿3 h,將收集到的濾液旋干得到黃色固體31．02 g,產(chǎn)率為75．2%。MS-ESI, m/z:260．2[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, DMSO-d6）δ 12．37 （s,1H）,10．00 （s, 1H）, 7．86 ～7．80 （m, 1H）, 7．75（s,1H）,7．55 ～7．50 （m,1H）,7．18 （td, J=8．1,1．2 Hz,1H）。

1．2．2 化合物4 的合成

將中間體3（31．02 g,118．82 mmol）溶于濃硫酸（338．06 mL）中,加熱至85 ℃下攪拌4 h,TLC 監(jiān)測反應結束,反應液冷卻至室溫,將反應液緩緩倒入攪拌的冰水（2 L）中,倒畢后靜置20 min,抽濾,濾餅水洗兩次隨后置于真空干燥箱中過夜,得紅棕色固體26．86 g,產(chǎn)率為92．7%。MS -ESI, m/z: 241．4[M-H]-。1H-NMR （400 MHz, DMSO -d6）δ:11．75（s,1H）,7．39 （s,1H）,7．33 （s,1H）。

1．2．3 化合物5 的合成

將中間體4（26．86 g, 110．07 mmol）溶于2 N NaOH（380 mL）中攪拌30 min,之后降溫至0 ℃,并向反應體系中滴加30%的過氧化氫水溶液65 mL,將其置于室溫下反應過夜,將反應液加入到攪拌的冰水中,濃鹽酸調節(jié)pH=8 ～9,過濾,濾餅水洗兩次,置于真空干燥箱干燥過夜,得淡黃色固體24．46 g,收率95%。MS - ESI, m/z: 234．3[M - H]-。1H - NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ:7．49 （dd, J=8．7,1．3 Hz,1H）,6．79 （dd, J=8．7,6．4 Hz,1H）。

1．2．4 化合物6 的合成

將中間體5（24．46 g, 104．5 mmol）溶于DMF（331 mL）中,加入NCS（13．95 g,104．5 mmol）,加熱至70 ℃,反應3 h,TLC 檢測反應完全,反應液冷卻至室溫,將反應液滴加至攪拌的冰水中,析出淡黃色固體,抽濾得到白色固體22．3 g,產(chǎn)率為96．1%。MSESI, m/z: 265．6[M - H]-。1H - NMR （400 MHz,DMSO-d6）δ 13．36 （s,1H）,7．72 （d, J=1．8 Hz,1H）,6．95 （s,1H）。

1．2．5 化合物7 的合成

將中間體6（22．3 g, 83．06 mmol）溶于EtOH（313 mL）中,之后加入醋酸甲脒（34．73 g, 333．90 mmol）,70 ℃回流反應29 h,旋蒸濃縮除去大部分EtOH 后析出大量固體,抽濾,濾餅少量水洗三次,真空干燥過夜,得到白色固體22．11 g,產(chǎn)率96%,無需純化可直接用于下一步反應。MS-ESI, m/z:276．2[M-H]-。1H-NMR（400 MHz,DMSO -d6）δ 12．72（s,1H）,8．22 （s,1H）,8．08 （s,1H）。

1．2．6 化合物8 的合成

將中間體7（22．11 g, 79．68 mmol）溶于二氯亞砜（800 mL）中,加入催化量的DMF（1 mL）,回流反應24 h,反應液濃縮至干,之后將剩余物置于冰浴下,滴加飽和碳酸氫鈉溶液調節(jié)pH 8 ～9,將粗產(chǎn)物在室溫下攪拌2 h,抽濾,濾餅使用少量水洗兩次；濾餅真空干燥過夜,得到淡黃色固體22．36 g,產(chǎn)率為94．9%。MS-ESI, m/z:294．8[M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6, 400 MHz）δ: 9．22 （s, 1H）, 7．27 ～7．12 （m,1H）。

1．2．7 化合物9 的合成

將化合物8（22．36 g,75．56 mmol）溶于1,4 -二氧六環(huán)溶液中,順序加入N,N′ - 二異丙基乙胺（21．48 g,166．23 mmol）、叔丁氧羰基哌嗪（16．88 g,90．67 mmol）,置于50 ℃下攪拌,6 h 后TLC 監(jiān)測反應完全,將反應體系冷卻至室溫,濃縮溶劑至干,乙酸乙酯溶解后,用10%的檸檬酸溶液洗滌有機相2 次,之后用飽和氯化鈉溶液洗滌1 次,有機相無水硫酸鈉干燥,抽濾,濾液濃縮至干,經(jīng)過快速柱層析得到黃色固體31．14 g,產(chǎn)率為92．5%。MS-ESI, m/z:446．1[M + H]+。1H - NMR （DMSO - d6, 400 MHz）δ:8．67 （s,1H）, 8．05 （s, 1H）, 3．83 （dd, J =6．6,3．9 Hz,4H）,3．54 （s,4H）,1．43 （s,9H）。

1．2．8 化合物10 的合成

將中間體9（31．14 g, 69．86 mmol）與中間體13（54．46 g,349．3 mmol）溶于1,4 -二氧六環(huán)/水的混合溶劑中（600 mL/150 mL）,之后加入氟化銫（31．83 g,209．58 mmol）與四三苯基膦鈀（8．08 g,6．986 mmol）,氮氣氛圍下90 ℃攪拌回流反應過夜,旋干反應溶劑后加入少許水稀釋,乙酸乙酯萃取水相三次,合并有機相,飽和食鹽水洗滌一次,無水硫酸鈉干燥,抽濾,濾液濃縮,經(jīng)硅膠柱色譜分離純化,得到淡黃色固體26．64 g,產(chǎn)率為80%。MS -ESI, m/z:499．10 [M + Na]+。1H - NMR （DMSO - d6, 400 MHz）δ:8．73 （s,1H）,7．40 （q, J=8．2 Hz,1H）,3．61 （s,6H）,3．37 （s,4H）,1．48 （s,9H）。

1．2．9 化合物11 的合成

將中間體10（26．64 g,55．85 mmol）溶于鹽酸-甲醇溶液中（240 mL）中,室溫條件下攪拌5 h,TLC檢測反應完全。反應完畢后,旋干反應液,得到鹽酸鹽固體（20．7 5g, 50．23 mmol）,之后加入飽和碳酸氫鈉水溶液調節(jié)pH =8 ～9,之后加入EA 萃取水相兩次,合并有機相,干燥、抽濾、濃縮得到淡黃色油狀液體,不做進一步純化直接投入下一步反應。將黃色油狀液 體（18．18 g, 48．26 mmol）溶 于 二氯 甲 烷（140 mL）,加入三乙胺（24．41 g,241．3 mmol）,降溫至-50 ℃,之后滴加丙烯酰氯（13．10 g ,144．78 mmol）,升溫至-40 ℃反應,TLC 監(jiān)測,30 min 后,反應進行完畢,加入飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應液,加入二氯甲烷萃取水相,之后二氯甲烷水洗。干燥,抽濾濃縮得到粗產(chǎn)物, 通過柱層析純化得到中間體（19．65 g,40．52 mmol）。在室溫下將得到的中間體溶于四氫呋喃與水（體積比為5∶1）的混合溶劑中,加入一水合氫氧化鋰,室溫條件下攪拌2 h,加入1 N HCl 水溶液調節(jié)pH=6 ～7,再加入EA 萃取水相,分液,有機相飽和鹽水洗滌1 次,干燥、抽濾、濃縮,得到的粗產(chǎn)物經(jīng)過柱層析純化得到16．40 g 白色固體粉末,產(chǎn)率為94%。MS -ESI, m/z:431．1 [M +H]+。1HNMR （DMSO-d6,400 MHz）δ: 10．30 （s, 1H）,8．70 （s, 1H）, 8．04 （s, 1H）, 7．34 ～7．40 （m,1H）,6．80 ～6．87 （m,3H）,6．16 ～6．20 （m,1H）,5．73 ～5．76 （m,1H）,3．77 ～3．93 （m,8H）。

1．2．10 化合物1 的合成

在制備型超臨界液相色譜SFC - 200（Thar,Waters）,將化合物11（4．25 g）通過CHIRALPAK AD-H 色譜柱（50 × 250 mm, 5 μm）分離得到ARS -1620,流動相為二氧化碳/甲醇（50∶50）,流速控制在130 g/min,得到白色固體粉末1．78 g,收率42%。ESI - MS, m/z: 431．1 [M + H]+。1H - NMR（400 MHz, DMSO - d6）: δ 10．28 （brs, 1H）, 8．69 （s,1H）,8．04 （s, 1H）, 7．39 ～7．33 （m, 1H）, 6．86 ～6．78 （m,3H）,6．18 （dd, J=2．6,16．7 Hz,1H）,5．75（dd,J=1．8,10．1 Hz,1H）,3．92 ～3．76 （m,8H）。

1．2．11 化合物13 的合成

將中間體12（74．18 g, 436．52 mmol）溶于二氯甲烷中降溫至0 ℃,隨后向反應體系滴加三溴化硼（328．09 g, 1．30 mol）,之后緩慢升溫至室溫反應3 h,TLC 監(jiān)測原料反應完畢,向反應體系中加入水淬滅反應,之后二氯甲烷萃取水相三次,飽和食鹽水洗滌有機相一次,無水硫酸鈉干燥、抽濾、減壓濃縮得到白色固體54．46 g,產(chǎn)率86%。MS - ESI, m/z 155．0[M-H]-。1H-NMR （400 MHz, DMSO-d6）δ:3．41（s, 2H）．7．35 （td, J =7．4, 5．9 Hz, 1H）, 6．70 ～6．61 （m,1H）,6．58 ～6．53 （m,1H）,5．74 （s,1H）。

2 結果與討論

2．1 起始原料與重要中間體的變更

以價廉易得的3 - 溴-2 - 氟- 苯胺為起始原料,相比較為昂貴的原研路線起始原料2 -氨基-4-溴-5 -氟苯甲酸（5）極大地降低了合成成本,另外中間體13（2 -氟-6 -羥基）苯硼酸的價格也較為昂貴,改用（2 -氟-6 -羥基）苯甲酸在三溴化硼作用下室溫環(huán)境脫甲基,就能以較高的純度與收率得到中間體13,也大大降低了成本。

2．2 中間體7 的后處理優(yōu)化

在對中間體的后處理過程中,發(fā)現(xiàn)中間體7 由于在PE:EA 的溶液體系中溶解性并不佳,通過尋找最佳的二元溶劑配比來對純度與收率達到平衡,從而避免繁瑣的柱層析操作,如表1 所示。

表1 不同比例的二元溶劑打漿對中間體7 純度與收率的影響Tab．1 Effect of different ratio of binary solvent beating on the purity and yield of intermediate 7

由表1 可以看出當打漿溶劑比例控制在PE∶EA=10 ∶1 時,中間體7,HPLC 檢測純度達到88．4%,并且打漿之后的收率也相對其他比例的溶劑更高,因此可選擇PE∶EA=10∶1 作為化合物7 的打漿溶劑。

2．3 中間體8 的后處理優(yōu)化

產(chǎn)物8 殘留的二氯亞砜對下一步反應影響極大,通過探索發(fā)現(xiàn)若對濃縮得到的產(chǎn)物8 不經(jīng)任何處理,直接投入下一步反應,會使得合成中間體9 的過程發(fā)生叔丁氧羰基哌嗪脫除Boc 的副反應,所以通過將中間體8 置于石油醚中打漿2 ～3 h,以去除產(chǎn)物中殘留的二氯亞砜。

2．4 中間體11 的合成條件優(yōu)化

在制備化合物11 時替換專利中的碳酸鈉,嘗試使用不同的堿來提高反應收率,最后發(fā)現(xiàn)使用氟化銫可以顯著提高產(chǎn)率。

表2 不同的堿對中間體7 收率的影響Tab．2 The influence of different bases on the yield of intermediate 7

2．5 中間體10 脫Boc 保護基條件的優(yōu)化

對于中間體10 脫除Boc 保護基,用鹽酸-甲醇替換原研路線中的三氟乙酸,后處理直接旋干,避免了繁瑣的后處理操作。

2．6 對于中間體10 中雜質的分離

鈴木偶聯(lián)反應完成以后,存在三苯基氧磷副產(chǎn)物,由于極性相近,中間體10 與副產(chǎn)物無法通過快速柱色譜分離,于是本文作者通過將中間體10 通過脫除Boc 成鹽的方式,將副產(chǎn)物三苯基氧磷留于有機相,而產(chǎn)物通過成鹽進入水相,由此將副產(chǎn)物分離。

3 結論

本文改進了ARS-1620 的合成方法,用3 -溴-2 -氟苯胺代替2 -氨基-4 -溴-3 -氟苯甲酸作為起始原料,經(jīng)桑德邁爾靛紅合成法、堿性水解開環(huán)、氯代、環(huán)合、氯代,叔丁氧羰基哌嗪取代得到重要中間體4 -（7 -溴-6 -氯-8 -氟喹唑啉-4 -基）哌嗪-1-羧酸叔丁酯（9）；以2 -氟-6 -甲氧基苯硼酸（I）為原料經(jīng)脫甲基化反應合成中間體2 -氟-6 -羥基苯硼酸（13）；中間體7 與13 經(jīng)Suzuki 偶聯(lián)反應、脫Boc 保護基、酯水解、手性柱色譜分離得到目標化合物ARS-1620,在保證收率的同時使得操作更加簡便,改進后的工藝路線總收率由原來19．65%的提升至33%。該方法具有合成路線新穎、原材料簡單易得、操作簡便,反應產(chǎn)物均采用打漿純化,避免柱層析分離,便于放大生產(chǎn),能較高收率得到目標產(chǎn)物,具有較高的實用價值。