施丹飛，崔戈，李勇

湖州師范學院附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 湖州 313000

血性胸腔積液是惡性腫瘤晚期累及胸膜常見的臨床并發(fā)癥，其主要的臨床癥狀有呼吸困難、胸痛、咳嗽等，這些癥狀不但降低患者生活質(zhì)量，甚至會威脅患者的生命[1-2]。收集、尋找血性胸腔積液中的腫瘤細胞，必要時行免疫組化進行進一步診斷和鑒別診斷，可為患者的臨床治療提供依據(jù)。近年來，細胞蠟塊聯(lián)合免疫組化的方法由于操作簡單、檢出率較高被廣泛應用于胸腔積液檢查中[3-4]。但是傳統(tǒng)細胞蠟塊制片中大量紅細胞常影響蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining, HE染色）制片及免疫組化制片結果。為此本研究通過改良血性胸腔積液細胞蠟塊的制作方法，提高細胞蠟塊的制片優(yōu)良率。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集湖州師范學院附屬第一醫(yī)院病理科2018年1月至2021年1月的55例臨床送檢的疑似惡性腫瘤的血性胸腔積液標本，其中男39例，女16例，年齡28～87（63.4±13.5）歲，55例標本全部進行HE染色和免疫組織化學染色。

1.2 主要設備和試劑 低速離心機（上海安亭科學儀器廠，TDL-80-2B）、脫水機（德國LEICA公司，ASP-300S）、包埋機（德國LEICA公司，Arcadia）、切片機（德國LEICA公司，RM2245）、電熱恒溫箱（上海精宏實驗設備有限公司，DHG-9123A）、染片機（德國LEICA公司，AUTOSTAINERXL）、顯微鏡（德國LEICA公司，DM2000），抗體購自福州邁新公司，采用KIT-5230試劑盒及DAB顯色系統(tǒng)顯色。

1.3 方法 每例患者均取4支容積為50 mL的試管，標記為A1、A2、A3和B管，A1、A2、A3管用于傳統(tǒng)細胞蠟塊制片（傳統(tǒng)組），B管用于改良細胞蠟塊制片（改良組）。具體操作如下：A1、A2、A3管分別采集胸腔積液15 mL，B管采集胸腔積液45 mL。4管胸腔積液皆以2 500 r/min離心10 min，用吸管吸干上清液。A1、A2、A3管采用傳統(tǒng)細胞蠟塊制作法，三管沉淀物富集于A1管中。步驟如下：①加入10%中性甲醛液混勻后固定10 min；②以2 500 r/min離心5 min，倒去固定液；③加入75%乙醇混勻，以 2 500 r/min離心5 min，倒掉75%乙醇；④輕輕加入95%的乙醇靜置30 min。B管采用改良細胞蠟塊制作法，首先添加5%的乙醇乙酸液（即95 mL 25%的乙醇加5 mL冰乙酸），混勻后靜置10 min用以破壞紅細胞，然后以2 500 r/min離心5 min，吸干上清液，留下沉淀，后續(xù)操作同傳統(tǒng)離心法（步驟①至④）。后續(xù)經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色及免疫組化染色。每例患者的胸水均制成2個蠟塊，共收集55例患者的胸水細胞蠟塊。

1.4 結果判讀 請同一位診斷醫(yī)師進行閱片，以組織活檢的HE及免疫組化染色結果為金標準，依據(jù)HE和免疫組化質(zhì)控的指標對制片質(zhì)量進行評判。HE制片優(yōu)良指標為：無破碎刀痕，無厚薄不均，染色清晰、核質(zhì)分明（細胞核呈紫藍色，細胞質(zhì)呈紅色），染色對比好；免疫組化Ki-67制片優(yōu)良指標為：無掉片，無非特異性染色，染色定位好（細胞核呈棕黑色，細胞質(zhì)、細胞膜無染色）。符合上述要求的組織切片判斷為優(yōu)良，不符合者均納入不良制片數(shù)，統(tǒng)計制片優(yōu)良率和制片不良率。制片優(yōu)良率=（優(yōu)良制片數(shù)/制片總數(shù)）×100%。制片不良率=（不良制片數(shù)/制片總數(shù)）×100%。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS22.0進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例（%）表示，2組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種細胞蠟塊制作方法的HE制片和免疫組化制片不良率比較 改良組的不良制片率顯著小于傳統(tǒng)組（χ2=8.419，P=0.004）。改良組的HE制片優(yōu)良率（94.6%）高于傳統(tǒng)組（74.5%）。改良組的不良制片率顯著小于傳統(tǒng)組（χ2=5.636，P=0.018）。改良組的HE制片優(yōu)良率（92.7%）高于傳統(tǒng)組（76.4%）。見表1和表2。

表1 兩種細胞蠟塊制作方法的HE制片不良率的比較[每組n= 55，例（%）]

表2 兩種細胞蠟塊制作方法的免疫組化制片不良率的比較[每組n=55，例（%）]

2.2 兩種細胞蠟塊制作方法的HE染色及免疫組化染色結果比較 傳統(tǒng)制作法由于紅細胞量多，導致HE染色切片厚薄不均，開裂掉片，整個視野充滿了紅細胞，腫瘤細胞分散不富集，免疫組化染色切片有非特異性染色，背景呈廣泛黃色；而改良制作法由于用乙醇乙酸液破壞了大部分紅細胞，HE染色切片沒有掉片，染色對比好，腫瘤細胞富集，免疫組化染色切片背景清晰。見圖1、圖2。

圖1 胸水細胞蠟塊傳統(tǒng)制作法（×100）

圖2 胸水細胞蠟塊改良制作法（×100）

3 討論

有些腫瘤晚期患者腫瘤范圍過大，有些高齡患者做手術有風險，皆不具備手術指征，此時胸腔積液細胞蠟塊病理診斷對于患者的病情評估具有重要意義。胸腔積液中原有的細胞呈分離狀，有時僅依靠涂片不能準確辨別出良惡性，在涂片質(zhì)量差、較少的細胞量以及變形、細胞重疊等因素影響下，難以對患者的疾病性質(zhì)作出正確的判斷，造成誤診率增加，細胞蠟塊技術可彌補這一缺點[5]。細胞蠟塊制作方法簡單，在基層病理科均可開展。而且細胞蠟塊可以永久保存，重復多次制片，多項研究表明細胞蠟塊可以進行免疫組織化學、分子檢測、原位雜交等，可對疾病進行深入研究[6-7]。常見的細胞蠟塊結合免疫組化的方法對于腫瘤的分型具有重要的作用，但是血性胸腔積液由于大量的紅細胞的存在，影響細胞蠟塊的切片質(zhì)量，給后續(xù)的HE染色及免疫組化染色增加了難度。對于免疫組化染色，富含大量紅細胞的細胞蠟塊經(jīng)脫水后會質(zhì)地變硬，切成片經(jīng)高溫修復后容易掉片，導致報告發(fā)布時間延遲；其次紅細胞中的類內(nèi)源性過氧化物酶會使組織產(chǎn)生非特異性染色，導致免疫背景加深，影響定位的準確性，繼而影響診斷臨床醫(yī)師的判斷，最后影響診斷結果。采用改良法則能較好地去除紅細胞的影響，保證診斷結果的可靠性，且不易掉片，保證診斷報告發(fā)布的及時性。

在本研究中，采用改良法對55例滲出性胸腔積液樣本進行細胞蠟塊的制片，其優(yōu)良率（HE：94.6%，免疫組化：92.7%）顯著高于傳統(tǒng)法（HE：74.5%，免疫組化：76.4%）。原理是乙醇乙酸液作用于紅細胞，使其快速膨脹裂解，裂解物可隨上清液被棄去，而間皮細胞，腫瘤細胞、淋巴細胞等結構完整、不變形，核質(zhì)分明，核仁清晰[8]，從而提高了腫瘤細胞的檢出率，使用紅細胞破壞法制成的切片經(jīng)HE染色后背景清晰、紅藍分明；經(jīng)免疫組化染色后無非特異性染色、幾乎無掉片，對細胞學診斷具有較高的實用價值?？偨Y本研究中的幾點注意事項：①選用容積為50 mL的試管，能聚集更多的細胞；②添加乙醇乙酸液的量以溶液略變淺紅色為宜，添加過多易引起細胞退變，添加過少則對紅細胞破壞不足；③在血性胸腔積液中添加乙醇乙酸液后，使用震蕩器震蕩能使兩者充分混勻，更利于紅細胞的去除。

綜上所述，血性胸腔積液使用改良法制作的細胞蠟塊，HE和免疫組化制片質(zhì)量好，對細胞學診斷的價值高，因此更具應用價值。另外，該方法操作簡便，試劑易配制，結果較穩(wěn)定。