徐伍， 徐瑞， 張信琴， 林加龍， 裴海峰

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130；2.西南交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610031；3.成都醫(yī)學(xué)院 護理學(xué)院，四川 成都 610500；4.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心內(nèi)科，四川 成都 610083)

DEAD-box蛋白質(zhì)家族隸屬于解旋酶超家族Ⅱ，是最大的解旋酶家族，因其結(jié)構(gòu)特征基序Asp(D)-Glu(E)-Ala(A)-Asp(D)而得名[1-2].DEAD-box蛋白具有獨特的12個保守基序，是其結(jié)合、水解ATP以及與RNA相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[3].DEAD-box RNA解旋酶3(DEAD-box RNA helicase 3,DDX3)是DEAD-box蛋白家族的重要成員，具有DEAD-box RNA解旋酶3 Y連鎖(DEAD-box RNA helicase 3 Y-linked，DDX3Y)和DEAD-box RNA解旋酶3 X連鎖(DEAD-box RNA helicase 3 X-linked，DDX3X)兩個同源物, 往往也將DDX3引為DDX3X.DDX3Y基因位于Y染色體上，僅表達雄性生殖系統(tǒng)[4-5]；而DDX3X基因位于X染色體上，廣泛表達于全身各組織，并參與細胞周期進展、先天免疫反應(yīng)、細胞凋亡、癌癥發(fā)生與抑制、病毒的復(fù)制周期等多種重要的細胞生理過程，因而受到了人們的廣泛研究[6-9].本研究旨在系統(tǒng)總結(jié)DDX3的病理生理學(xué)作用，著重其與疾病的關(guān)系及生物學(xué)作用，以期探明可能的研究方向.

1 DDX3簡介

DDX3作為一種結(jié)構(gòu)高度保守并依賴ATP的RNA解旋酶，廣泛存在于各類真核生物中.1997年研究人員首次發(fā)現(xiàn)了人源DDX3蛋白，并通過原位雜交技術(shù)將其基因精確定位于Xp11.3-p11.23位點[10].人源DDX3編碼基因長約16KB，共包含16個內(nèi)含子及17個外顯子，編碼5.3KB轉(zhuǎn)錄本，對應(yīng)662個氨基酸的多肽，富含絲氨酸(11.3%)和甘氨酸(11.4 %)[4,11].與所有的DEAD-box RNA解旋酶相似，DDX3的解旋酶核心由兩個類似RecA樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中包含13個特征性解旋酶序列基序，并包括同義基序Ⅱ，該基序以單個字母代碼讀取為D-E-A-D[12-13]. DDX3解旋酶核心的兩側(cè)分別是一個序列復(fù)雜度低且具有RS樣結(jié)構(gòu)域的C末端和一個帶有核輸出信號(nuclear export signal，NES)且序列復(fù)雜度低的N末端[12，14].研究人員通過蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)和X射線衍射分析，準確得到了DDX3解旋酶結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，該晶體屬于單斜空間群P21，其具體晶胞參數(shù)：a=43.85 ?,b=60.72 ?,c=88.39 ?，α=γ=90°,β=101.02°，并發(fā)現(xiàn)DDX3結(jié)晶中存在共結(jié)晶配體，進一步研究發(fā)現(xiàn)該配體能提高DDX3的熱穩(wěn)定性[15-16].DDX3作為一種穿梭蛋白定位于細胞核和細胞質(zhì)，并在其中發(fā)揮相應(yīng)的病理生理學(xué)功能，既往研究發(fā)現(xiàn)DDX3未修飾單體形式(相對分子量為73.2)過大，無法有效通過核孔被動擴散進入細胞質(zhì)，需要N末端富含亮氨酸的NES與核出口受體細胞染色體維持蛋白1 (chromosomal region maintenance 1, CRM1，也稱Exportin-1)結(jié)合，從而定位至核膜孔的細胞質(zhì)側(cè)[17-18].最近發(fā)現(xiàn)，DDX3的核輸出不僅由CRM1介導(dǎo)，還依賴于NES和以活化GTP結(jié)合形式運行的單體鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白Ran[17].

2 DDX3的調(diào)控因素

許多因素會造成DDX3基因突變致使其功能的改變，研究人員通過外顯子組測序在髓母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了DDX3突變，DDX3的突變被認為是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要因素[19-21].DDX3的轉(zhuǎn)錄同樣受到多種因素的調(diào)節(jié)，在人乳頭瘤病毒相關(guān)的肺癌中，p53 對DDX3的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用，p53的狀態(tài)決定了DDX3的表達水平[22-23]；在乳腺癌伴缺氧條件下，低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)通過與正常乳腺上皮MCF10A細胞中DDX3啟動子區(qū)的低氧誘導(dǎo)因子應(yīng)答元件相結(jié)合，從而誘導(dǎo)激活DDX3的轉(zhuǎn)錄，因此核DDX3也被認為是乳腺癌不良預(yù)后的預(yù)測因子之一[24-25].丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的結(jié)構(gòu)核心蛋白被認為是第一個可以與人類DDX3相互作用的病毒蛋白，相關(guān)功能實驗表明，HCV核心蛋白也許能夠增強DDX3轉(zhuǎn)錄共激活子的功能[11].在翻譯水平，激活轉(zhuǎn)錄因子E74 樣因子3(E74-like factor 3，elF3)和Cap依賴性翻譯或抑制E74 樣因子4(E74-like factor 4，elF4)均調(diào)控DDX3的翻譯[26-27].另外DDX3的表達還受1型艾滋病病毒(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)Tat(HIV-1編碼的反式激活因子)刺激[28]；在肝癌中，應(yīng)用卡馬拉素(rottlerin)可上調(diào)DDX3在腫瘤細胞中的表達[29].此外，生活習(xí)慣也密切影響著DDX3的表達，包括吸煙、飲酒及其他習(xí)慣，且男性表達水平高于女性[30].

3 DDX3與疾病的關(guān)系

DDX3對下游眾多分子具有調(diào)控作用，參與了先天免疫反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生與抑制、病毒的周期復(fù)制等多種生物學(xué)過程，并在其中發(fā)揮了重要的病理生理學(xué)作用[7,9,31].長期以來，DDX3與疾病的關(guān)系被不斷探索，其與腫瘤的研究成果豐富，與病毒之間也有明確的聯(lián)系.

3.1 DDX3與腫瘤的關(guān)系

DDX3可充當酪蛋白激酶1ε(casein kinase 1ε, CK1ε)的調(diào)節(jié)亞基，直接結(jié)合CK1ε并刺激激酶活性，進一步促散亂蛋白 (disheveled protein，Dvl)磷酸化，從而使β-連環(huán)蛋白(β-catenin)移位進入細胞核并觸發(fā)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，Wnt/β-catenin信號下游有眾多靶基因被調(diào)控，主要包括轉(zhuǎn)錄因子Snail1、基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7，MMP7)、鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS)、成纖維細胞特異蛋白1(fibroblast-fpecific protein 1,FSP1)和纖連蛋白等，這些靶點基因大多參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)、侵襲、炎癥、遷移、凋亡和纖維化等過程[32-38].Wnt/β-catenin和EMT是DDX3在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮致癌或抑癌雙重作用的關(guān)鍵.

在KRAS突變的結(jié)直腸癌細胞中，質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染結(jié)果表明DDX3可通過CK1ε/Dvl2軸激活β-catenin/T細胞因子(T cell factor，TCF)，進而促進細胞侵襲和異種移植肺腫瘤的結(jié)節(jié)形成[39]；而在KRAS野生型結(jié)直腸癌細胞中，發(fā)現(xiàn)DDX3可通過DDX3/KRAS/ROS/HIF-1α/DDX3級聯(lián)反饋環(huán)增強細胞侵襲性[40].以上研究明確DDX3的致癌作用，解釋了高表達DDX3結(jié)直腸癌患者臨床總體生存率較差的原因[41].大型隊列分析發(fā)現(xiàn)低表達DDX3的結(jié)直腸癌患者預(yù)后也較差，且癌細胞向遠處轉(zhuǎn)移更加頻繁.進一步實驗發(fā)現(xiàn)低表達DDX3可激活Snail/E-鈣粘著蛋白(E-cadherin)信號通路，從而促進了結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移[42].因此，DDX3也被認為具有抑癌作用.

在非小細胞肺癌中，應(yīng)用質(zhì)粒構(gòu)建等方法，使E6癌蛋白和p53突變共同誘導(dǎo)DDX3失活，MDM2/Slug/E-cadherin途徑就被激活，表現(xiàn)為腫瘤惡性程度增加和預(yù)后不良，反映了DDX3的抑癌作用[22]；而在小細胞肺癌中，高表達DDX3與癌細胞的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[43].盡管DDX3在肺癌中發(fā)揮雙重作用，但目前被視為肺癌的治療靶點，本研究認為不應(yīng)一概而論，臨床應(yīng)用應(yīng)遵循個體化精準醫(yī)療.

在肝癌細胞中檢測到過表達DDX3，經(jīng)錨定非依賴性生長分析，其被鑒定為肝癌發(fā)生中的轉(zhuǎn)化基因[44]；Chang等[45]發(fā)現(xiàn)，在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)陽性的原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者中，DDX3表達水平較低，而在HCV陽性的患者中則不表達，進一步通過集落形成實驗和質(zhì)粒構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，DDX3主要通過與特異性蛋白1(specificity protein 1，SP1)結(jié)合而增強p21(waf1/cip1)啟動子活性的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮其對腫瘤生長的抑癌作用[46].由于DDX3同樣與病毒有著直接關(guān)聯(lián)，故在研究肝癌時不應(yīng)忽略病毒的效應(yīng).

在口腔鱗狀細胞癌中，非吸煙患者的組織免疫組化染色表明，低表達的DDX3嚴重影響總體生存率[30]；對吸煙患者而言，高表達DDX3與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)并可預(yù)測不良生存率[47].這種現(xiàn)象可能是因為吸煙作為一種誘因造成DDX3突變，使其由抑癌轉(zhuǎn)變?yōu)橹掳?

熒光素酶報告表明，被HIF-1α上調(diào)后的DDX3通過誘導(dǎo)EMT進程的方式增強乳腺癌侵襲[22]；髓母細胞瘤細胞活力增加則是由于DDX3突變與突變的β-catenin結(jié)合增加了TCF啟動子的反式激活[48].目前，DDX3對于癌癥的發(fā)生發(fā)展起著促進或抑制雙重作用，明確兩者間的關(guān)系一直備受關(guān)注，理清此關(guān)系能為癌癥的治療提供更多的可行途徑.

3.2 DDX3與病毒感染的關(guān)系

在免疫反應(yīng)中，DDX3發(fā)揮著重要的抗病毒作用，主要調(diào)節(jié)視黃酸誘導(dǎo)型基因I(retinoic acid-inducible gene I，RIG-I)樣受體介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答，激活的RIG-I結(jié)合線粒體抗病毒信號(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)銜接蛋白，最終致使I-κB激酶-ε(I-kappa-B kinase-ε，IKKε)和TANK結(jié)合激酶1(tank binding kinase-1，TBK1)復(fù)合物的募集， IKKε/TBK1復(fù)合物能使干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factors 3，IRF3)、干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factors 7，IRF7)磷酸化和核易位，從而激活Ⅰ型干擾素(type-I interferon，IFN-I)轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生IFN-β，同時DDX3亦為IKKε/TBK1復(fù)合物的重要組成部分[17,49-51].DDX3同HCV、HIV-1、HBV、甲型流感病毒、日本腦炎病毒、登革熱病毒和西尼羅河病毒等多種病毒密切相關(guān).全基因組遺傳篩選結(jié)果表明DDX3是HCV感染的宿主因子，對HCV復(fù)制極其重要[52].對于HIV-1，DDX3作為其輔助因子，能攜同CRM1介導(dǎo)HIV-1 Rev RNA的核輸出并促進mRNA的翻譯[28].在HBV中，DDX3能結(jié)合并抑制HBV的DNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶，從而減少HBV的復(fù)制[53].近期通過免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，作為一種抗病毒蛋白，DDX3可與甲型流感病毒NS1和NP蛋白相互作用，發(fā)揮抗病毒作用，DDX3與日本腦炎病毒5′和3′非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)控病毒感染[54-55].近期還發(fā)現(xiàn)了DDX3的N端能相互作用于登革熱病毒衣殼，且可能與該病毒感染后期存在聯(lián)系[56].總之，研究人員明確了DDX3是一種有效的抗病毒蛋白，并將其作為許多病毒的治療靶點，靶向DDX3研究有效的抗病毒藥物能為HIV等流行病提供解決方案.

4 DDX3的生物學(xué)作用

4.1 參與RNA活動

RNA諸多代謝活動均有DDX3參與，包括RNA轉(zhuǎn)錄和剪接、mRNA轉(zhuǎn)運和翻譯等.DDX3參與RNA轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)在對轉(zhuǎn)錄因子的影響，涉及的轉(zhuǎn)錄因子包括上文所提及的Snail1、IRF3、IRF7和SP1[34,46,49].在DDX3的C端，富含精氨酸-絲氨酸的RS結(jié)構(gòu)域能與核出口因子Tip相關(guān)蛋白(tip-associated protein，TAP)相互作用，而TAP能直接結(jié)合mRNA繼而介導(dǎo)mRNA輸出，TAP還有助于mRNP(信使核糖核蛋白，包含蛋白質(zhì)、snRNA和mRNA)核出口，故DDX3可參與mRNA的轉(zhuǎn)運[57-58].斑點印跡分析法結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDX3能與N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)的去甲基化酶烷基化修復(fù)同源蛋白5相互作用并影響其活性，通過調(diào)節(jié)mRNA的去甲基化發(fā)揮對mRNA的修飾作用[59-60].HCV核心可同DDX3的C端(氨基酸553-622)結(jié)合，HCV核心的N末端(氨基酸1-59)介導(dǎo)它們的相互作用，這種相互作用的影響被認為是HCV的mRNA剪接，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的操縱，最終影響HCV復(fù)制[61-62]. 質(zhì)譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDX3能依賴外顯子連接復(fù)合體與剪接的mRNA相結(jié)合，剪接因子還有其RS結(jié)構(gòu)域，故DDX3可能有助于RNA 剪接[63].DDX3也是胞質(zhì)應(yīng)激顆粒的組成部分，暗示了DDX3在翻譯調(diào)控中的作用[64].事實上，DDX3能與eIF4E及其他幾種翻譯起始因子包括eIF3，eIF2a，eIF4a，eIF4G和poly(A)結(jié)合蛋白1(Poly(A)-binding protein 1，PABP1)相互作用，增強含有結(jié)構(gòu)化的5’非翻譯區(qū)的mRNA翻譯，其他研究則發(fā)現(xiàn)DDX3可與eIF3和40S核糖體相互作用以支持功能性80S核糖體的組裝，此外，DDX3還能通過與Tat蛋白交互增強病毒mRNA翻譯[26,65-69]；同時DDX3也能充當翻譯抑制因子，雙順反子報告表明DDX3將eIF4E捕獲于翻譯非活動復(fù)合物中以阻滯與eIF4G的交互，從而抑制了Cap依賴性翻譯[26].

4.2 調(diào)節(jié)細胞周期

DDX3同樣對細胞周期發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用.既往發(fā)現(xiàn)DDX3定位不僅與CRM1相關(guān)，同時會隨細胞周期的進程而變化，G0期定位于細胞核，而G1/S期則主要定位于細胞質(zhì)，其定位的改變是同生物學(xué)功能相對應(yīng)的[70].在有絲分裂的前期或中期，細胞核內(nèi)DDX3積累增加，此現(xiàn)象可能與其在有絲分裂期間中心體調(diào)節(jié)和染色體分離有關(guān)，Pek等[71]提示DDX3在HeLa細胞的前期或前中期定位于接近染色體聚集的位置[72]；Chen等[73]經(jīng)免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)DDX3與中心體共定位；Brennan[72]的圖像還提示DDX3在有絲分裂中期至胞質(zhì)分裂期間與紡錘體相關(guān)聯(lián)，此外 DDX3與中心體相關(guān)的p53共定位，DDX3下調(diào)致染色體錯位、分離缺陷和多極有絲分裂,并造成G2/M延遲和細胞死亡等均佐證了此觀點[73].與Chen等[73]的研究一致，Brennan等[72]的研究也顯示，敲除DDX3會明確減緩細胞周期G2/M期的進展，這表明可能需要增加DDX3的表達和核積累，細胞才能順利通過G2/M期的進展.起初人們發(fā)現(xiàn)在DDX3敲低的細胞中，細胞周期加速并提早向S期過渡，此過程伴隨著細胞周期蛋白D1(G1早期至中期的調(diào)節(jié)劑)的增加[74].進一步研究表明，過表達的DDX3會提高p21并下調(diào)細胞周期蛋白D1，導(dǎo)致S期阻滯，DDX3的Q基序上的蘇氨酸204被細胞周期蛋白B/cdc2磷酸化，導(dǎo)致DDX3的調(diào)節(jié)功能喪失[75-76].然而，細胞周期蛋白B的翻譯尤其取決于DDX3的水平[77].此外，DDX3亦可通過促進細胞周期蛋白E1的翻譯調(diào)控細胞周期[78].最新研究也認為，DDX3的抑制作用會對所有階段的細胞產(chǎn)生影響，并導(dǎo)致細胞周期的整體進程延遲[6].

4.3 調(diào)節(jié)細胞凋亡

細胞凋亡為細胞生命重要的進程，受多方面各個因素的調(diào)節(jié)，DDX3是眾多調(diào)節(jié)分子中的一員.現(xiàn)有研究表明，DDX3能抑制細胞凋亡，既可調(diào)控外源性凋亡信號，亦能選擇性調(diào)控內(nèi)源性凋亡信號.2D凝膠位移和質(zhì)譜分析表明，DDX3被鑒定為TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體2(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2，TRAIL-R2)相關(guān)蛋白，TRAIL-R2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及DDX3的解離，此過程抵消了死亡信號.DDX3還與死亡受體、糖原合成酶激酶-3 (serine protein kinase 3，GSK3)和細胞凋亡抑制蛋白-1 (Cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP-1)形成死亡拮抗復(fù)合物，調(diào)控外源性凋亡信號抑制凋亡[79].研究表明，百草枯可能通過上調(diào)死亡受體5和抑制抗凋亡蛋白DDX3/GSK3來誘導(dǎo)外源性細胞凋亡途徑，進而減少抗凋亡復(fù)合物的產(chǎn)生，為抵抗百草枯肺毒性提供了可能途徑[80].DNA損傷后，內(nèi)源性凋亡信號可被DDX3選擇性調(diào)控.在無功能p53或表達突變的細胞中，DDX3通過抑制半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)而抑制細胞凋亡；相反，在p53野生型表達的細胞中，DDX3通過促caspase-7結(jié)合p53，增加p53在胞內(nèi)的積累，正向調(diào)節(jié)喜樹堿誘導(dǎo)的凋亡信號[8].在DDX3不表達的情況下，Caspase-6和Caspase-9激活被阻斷，從而可保護DDX3敲低細胞不受細胞凋亡的影響[26].綜上，DDX3在細胞凋亡的調(diào)節(jié)中既能抗凋亡，亦能促凋亡.

5 總結(jié)與展望

眾多研究不斷加深著對DDX3的認知，它在多種生理病理進程中發(fā)揮著極其重要的作用.研究主要通過實驗探究DDX3的作用，多在質(zhì)粒構(gòu)建、細胞轉(zhuǎn)染、蛋白印跡法、免疫組化分析和熒光素酶報告分析等技術(shù)上增減或按研究進行改進，但也會出現(xiàn)部分相反的結(jié)果，例如促癌與抑癌，因此，在進行研究時更應(yīng)關(guān)注實驗的限定條件，準確的條件限制能得到更為準確的結(jié)果，更加明確DDX3的病理生理學(xué)作用.

DDX3可調(diào)控腫瘤、病毒感染等疾病的發(fā)生發(fā)展，具有促進或抑制癌細胞發(fā)生發(fā)展的雙重作用，目前被認為是癌癥的治療靶點.DDX3的抗病毒功能及本身的生物學(xué)特性，使HIV、HCV等全球性傳染性疾病的治療有了新的途徑.因此研發(fā)DDX3抑制劑靶向相關(guān)疾病的治療，是DDX3公認的研究方向.迄今為止，人們通過對DDX3病理生理學(xué)的研究已經(jīng)研發(fā)出了RK-33、FE-15、NZ51、酮咯酸鹽、阿霉素等多種抑制劑[81-84].例如應(yīng)用最多的RK-33能結(jié)合DDX3的ATP結(jié)合域，從而阻斷其在肺癌、尤文氏肉瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌細胞中解旋酶的活性，同時RK-33可使高表達DDX3癌細胞的細胞周期G1停滯和細胞凋亡[85-89].因此，對于DDX3高效抑制劑的開發(fā)是未來長期內(nèi)的突破點，同時抑制劑的研發(fā)方法也值得深入探究.最新的DDX3抑制劑被應(yīng)用在抗病毒感染中，提示進一步研發(fā)相關(guān)制劑調(diào)控DDX3也是病毒類疾病的有效治療途徑[54,90].除此之外，DDX3是否參與各類新型病毒的感染與復(fù)制，是否可成為治療靶標，值得進一步探討.

DDX3對細胞周期、細胞凋亡的作用提示，靶向調(diào)控DDX3以抑制癌癥細胞周期增殖或促進癌細胞凋亡，能為癌癥的治療提出新方案.目前，關(guān)于DDX3翻譯后修飾的研究較少，而DDX3本身具有眾多潛在的翻譯后修飾位點，故通過翻譯后修飾調(diào)控DDX3的活性及功能可能為相關(guān)疾病的治療提供可靠途徑.分布廣泛且參與細胞各項生命活動的DDX3是值得被研究的，盡管已經(jīng)有了許多研究成果，但因其具有雙刃劍的特性，故需要更加精準的研究以明確其病理生理學(xué)作用，從而為與DDX3相關(guān)的疾病治療提供更加可靠的策略.