肖素軍， 肖亞君， 吳培賽， 彭忠田

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是常見的慢性肝病，臨床上組織學和影像學檢查顯示超過5%肝細胞出現(xiàn)脂肪變性[1]，且無繼發(fā)性病因，如藥物、過量飲酒等。在全球范圍內(nèi)，NAFLD的發(fā)病率約為25%[2]。盡管脂肪變性本身是相對良性且可逆的，但仍有8%～20%的單純肝細胞脂肪變性會進展為非酒精性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，甚至肝纖維化或肝癌[3-4]。NAFLD的主要發(fā)病機制是脂質(zhì)代謝失衡以及肝臟脂毒性的產(chǎn)生。研究表明，自噬在NAFLD的發(fā)生和發(fā)展中也起著至關(guān)重要的作用[5-9]。水飛薊賓(silibinin)是從水飛薊的果實中提取的水飛薊素，是一種包含活性黃酮木素和類黃酮的混合物，具有清除自由基、抗氧化和抗炎癥的功能[10]。目前水飛薊賓在臨床上主要用于治療慢性肝炎、急性肝炎、肝臟脂肪變性以及肝硬化等疾病，但對于其是否通過激活自噬通路機制來緩解NAFLD，目前仍鮮有研究。鑒此，本研究旨在通過構(gòu)建油酸誘導(dǎo)的HepG2細胞脂肪變性模型，探討水飛薊賓緩解HepG2細胞脂質(zhì)沉積的機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料 HepG2細胞由湖南醫(yī)藥學院生物醫(yī)學中心保存并提供。主要試劑和儀器：水飛薊賓(sigma,Lot:6015V52LB)、油酸(sigma,Lot:0459K0731V)、氯喹(Macklin,CAS:54-05-7)、油紅O(sigma-aldrich，O9755)、重組Anti-LC3B抗體(abcam,ab192890)、GAPDH抗體(proteintech,10494-1-AP)、HRP-抗兔IgG(中杉金橋，ZB-5301)、甘油三酯(triglyceride，TG)檢測試劑盒(南京建成，A110-1-1)、BCA檢測試劑盒(碧云天，BD0028)、顯微鏡(奧林巴斯BX53)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-5200)、SpectraMax M5-多功能酶標儀。

1.2實驗方法

1.2.1 藥物配置 (1)水飛薊賓：溶解于DMSO中，配置成1×104μM母液，使用時稀釋1 000倍，終濃度為10 μM。(2)氯喹:溶解于雙蒸水中，配置成60 mM母液，使用時稀釋1 000倍使用，終濃度為60 μM。(3)油酸：溶解在無水乙醇中，配置成40 mM母液，70 ℃水浴30 min助溶，用0.22 μm濾器過濾除菌，-80 ℃分裝保存，使用時用1%無脂肪酸BSA-MEM培養(yǎng)基稀釋100倍，終濃度為0.4 mM。

1.2.2 構(gòu)建油酸誘導(dǎo)的HepG2細胞脂肪變性模型[11]

用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞，待細胞生長至融合度約60%時，用不含脂肪酸的1% BSA-MEM培養(yǎng)細胞過夜。對照組繼續(xù)用不含脂肪酸的1% BSA-MEM培養(yǎng)，油酸組(OA組)、油酸+水飛薊賓組(OA+S組)、油酸+氯喹組(OA+CQ組)、油酸+氯喹+水飛薊賓組(OA+CQ+S組)均加入0.4 mM油酸，AO+S組在油酸刺激24 h后加入10 μM的水飛薊賓繼續(xù)培養(yǎng)24 h。OA+CQ組采用油酸刺激24 h后再加入60 μM氯喹繼續(xù)培養(yǎng)24 h。OA+CQ+S組則在油酸刺激24 h后，用60 μM氯喹預(yù)處理1 h，再加入水飛薊賓繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 油紅O染色 將0.5 g油紅O粉末加入到100 ml異丙醇中，配置成0.5%油紅O母液，60 ℃水浴溶解。使用時，取6 ml油紅加入4 ml雙蒸水，雙層濾紙過濾，制備油紅O工作液，全程避光(油紅O工作液現(xiàn)配現(xiàn)用)。用磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)將細胞洗3次，吸凈PBS，加入4%多聚甲醛固定15 min。棄去固定液，雙蒸水洗兩次，待細胞培養(yǎng)板干燥后，加入油紅O工作液反應(yīng)25 min。用雙蒸水清洗兩次，而后用異丙醇溶液漂洗5 s，加入適量雙蒸水洗滌，待樣品干燥后在顯微鏡下觀察。

1.2.4 Western blot檢測 裂解細胞后用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白質(zhì)通過12% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF固定膜上，并分別置入LC3B抗體(用含5% BSA的TBST液稀釋，稀釋比例為1∶1 000)、GAPDH抗體(用含5%BSA的TBST液稀釋，稀釋比例為1∶10 000)，4℃孵育過夜。用辣根過氧化物酶標記的IgG進行印跡分析。用Image J軟件進行灰度值分析，以LC3BⅡ灰度值與LC3BⅠ灰度值的比值表示LC3蛋白表達量。

1.2.5 TG檢測 用胰酶消化細胞，以1 000 r/min條件離心10 min，棄上清液，留細胞沉淀。用PBS洗兩次，再次以1 000 r/min離心10 min，棄上清。加入300 μl PBS，冰水浴條件下通過超聲破碎(功率300 W，5 s/次，間隔1 min，重復(fù)5次)，制備好的勻漿液，在酶標儀下通過波長510 nm光進行檢測。

2 結(jié)果

2.1各干預(yù)組HepG2細胞脂質(zhì)沉積情況 油紅O染色結(jié)果顯示，OA組脂質(zhì)沉積程度較對照組明顯，提示0.4 mM能夠引起HepG2細胞脂肪變性，造模成功。OA+S組HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的程度較OA組輕，提示水飛薊賓可緩解油酸誘導(dǎo)的HepG2細胞脂質(zhì)沉積。OA+CQ+S組HepG2細胞內(nèi)出現(xiàn)顯著脂質(zhì)沉積，與OA組情況相似。見圖1。

圖1 顯微鏡下觀察HepG2細胞脂質(zhì)沉積所見(油紅O染色)

2.2各干預(yù)組TG水平比較 經(jīng)油酸處理后，HepG2細胞TG水平上升，OA組、OA+S組、OA+CQ+S組的TG水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。水飛薊賓處理后，HepG2細胞的TG水平獲得下調(diào)，OA+S組TG水平顯著低于OA組(P<0.05)。但水飛薊賓的干預(yù)效應(yīng)會受到氯喹的阻斷，OA+CQ+S組的TG水平顯著高于OA+S組(P<0.05)，但與OA組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各干預(yù)組TG水平比較

2.3各干預(yù)組LC3BⅡ/LC3BⅠ水平比較 油酸刺激后LC3BⅡ/LC3BⅠ水平下調(diào)，OA組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。油酸刺激后再加入水飛薊賓處理24 h，LC3BⅡ/LC3BⅠ水平上調(diào)，OA+S組與OA組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。應(yīng)用自噬抑制劑氯喹處理后，LC3BⅡ/LC3BⅠ水平上調(diào)，OA+CQ組、OA+CQ+S組與對照組、OA組及OA+S組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 Western blot檢測自噬標志蛋白LC3BⅡ/LC3BⅠ結(jié)果圖

表2 各干預(yù)組LC3BⅡ/LC3BⅠ水平比較灰度值]

3 討論

3.1NAFLD始于肝臟中TG的異常積累，嚴重者可進展為肝損傷、肝纖維化。肝臟脂肪變性與營養(yǎng)過剩、肥胖、胰島素抵抗等密切相關(guān)。肝損傷與多種機制有關(guān)，包括肝細胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和線粒體功能障礙、免疫反應(yīng)的改變和炎性細胞因子的增加[12]。因此，NAFLD是多因素參與的病理過程。自噬是機體的一種保護性反應(yīng)，有助于維持機體穩(wěn)態(tài)并促進細胞生存。脂質(zhì)吞噬是細胞內(nèi)雙層膜包裹脂滴，并將其輸送至溶酶體進行降解，是一種特殊的自噬。脂質(zhì)吞噬能將細胞內(nèi)異常脂滴降解以使細胞處于穩(wěn)態(tài)。越來越多的證據(jù)表明，在NAFLD患者以及NAFLD動物模型中肝臟自噬受到損傷，高胰島素血癥和一些自噬相關(guān)的蛋白如Atg7和Atg5的下調(diào)與自噬體的形成障礙有關(guān)[13]。自噬異?？梢詫?dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累、損傷以及炎癥，甚至纖維化和癌變。

3.2目前，對于NAFLD缺乏有效的治療措施，最好的方法僅限于平衡飲食、規(guī)律體育鍛煉和減重等生活方式層面上的干預(yù)[14]。水飛薊賓是從植物水飛薊中提取的一種天然黃酮類化合物，具有穩(wěn)定肝細胞膜、抗氧化以及保護肝臟等作用，臨床上用于護肝治療。研究表明，水飛薊賓在NAFLD患者中的治療作用，包括降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平，改善胰島素抵抗，降低血漿總膽固醇、TG、低密度脂蛋白-膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)水平[15]。研究表明，水飛薊賓可降低大鼠血清TG水平，減輕肝臟相對重量和肝細胞脂質(zhì)沉積，改善胰島素抵抗，上調(diào)脂肪分解相關(guān)基因脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)的表達，從而改善高脂飲食引起的肝臟損傷[16]。然而，水飛薊賓減輕NAFLD的機制尚未完全了解。

3.3NAFLD主要表現(xiàn)為大泡樣脂肪變性，是肝臟對飲食和脂肪組織高水平脂肪酸的反應(yīng)[17]。飽和棕櫚酸(PA,16∶0)和單不飽和油酸(OA，9-順式18∶1)是飲食和血清中最為豐富的脂肪酸，進入肝細胞的脂肪酸(fatty acid,FA)主要合成TG[18]。本研究采用含0.4 mM油酸的1%無脂肪酸BSA-MEM培養(yǎng)HepG2細胞24 h，細胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增加，提示成功構(gòu)建體外NAFLD模型。自噬過程中LC3/Atg8被Atg4在羧基端剪切，生成胞質(zhì)LC3Ⅰ。LC3Ⅰ通過泛素樣反應(yīng)，使磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，生成LC3Ⅱ，它可以附著到自噬體膜上，是自噬體的結(jié)構(gòu)蛋白，最終LC3Ⅱ被溶酶體降解。本研究結(jié)果顯示，加入油酸刺激24 h后，HepG2細胞內(nèi)TG含量顯著增加，且自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平下調(diào)，提示油酸可用于誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性，且能抑制細胞的自噬水平。加入油酸后用自噬抑制劑氯喹處理HepG2細胞，與單純用油酸刺激比較，LC3BⅡ/LC3BⅠ水平上升，提示氯喹可通過抑制溶酶體功能抑制LC3Ⅱ的降解從而抑制自噬。在油酸刺激的基礎(chǔ)上加入水飛薊賓，HepG2細胞內(nèi)TG含量顯著降低，且細胞LC3BⅡ/LC3BⅠ水平有所恢復(fù)；而在油酸刺激HepG2細胞后，用自噬抑制劑氯喹預(yù)處理1 h，再加水飛薊賓干預(yù)24 h，細胞TG含量顯著增加，提示水飛薊賓通過增強自噬緩解油酸誘導(dǎo)的HepG2細胞脂質(zhì)沉積。

綜上所述，通過油酸刺激HepG2細胞可以建立肝細胞脂肪變性的體外模型，水飛薊賓通過增強自噬改善油酸誘導(dǎo)的HepG2細胞脂質(zhì)沉積，為臨床用藥提供了理論依據(jù)。