海佳怡，鄭思思，候建平，龍 鑫，王 穩(wěn)*，朱麗琳

(1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海西寧 810016；2.西寧市野生動物疫源疫病監(jiān)測站，青海西寧 810001)

高山兀鷲(Gypshimalayensis)也稱喜馬拉雅兀鷲，隸屬于鷹形目(Accipitriformes)、鷹科(Accipitridae)，為國家Ⅱ級保護(hù)鳥類。世界自然保護(hù)聯(lián)盟(International Union for Conservation of Nature，IUCN)在2014年將其列入瀕危物種紅色名錄，保護(hù)等級為近危(Near threatened，NT)。高山兀鷲作為大型猛禽，體重可達(dá)8 kg～12 kg，在長期進(jìn)化過程中，形成以腐肉為食的獨特食性。該食性有助于降低腐肉中細(xì)菌和病毒在自然環(huán)境中的擴(kuò)散，對維持生態(tài)系統(tǒng)平衡有重要意義[1]。高山兀鷲對腐食的適應(yīng)性機(jī)制歷來是研究的重點和熱點。Blumstein D等[2]總結(jié)食腐動物適應(yīng)腐食的8種可能機(jī)制中，特化的腸道微生物組(gut microbiome)被認(rèn)為在腐食適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Roggenbuck M等[3]通過分析紅頭美洲鷲(Cathartesaura)和黑頭美洲鷲(Coragypsatratus)的腸道微生物組，發(fā)現(xiàn)這兩種鷲類的腸道微生物多樣性非常低，主要由隸屬于梭菌屬(Clostridium)和梭桿菌門(Fusobacteria)的微生物構(gòu)成。而這兩種類型的微生物對于其他動物而言，通常具有致病性。研究者推論，大量定植于這兩種鷲類腸道的微生物，與其他病原菌形成種間競爭關(guān)系，進(jìn)而抵御腐食中其他病原菌的生長。本研究將探究高山兀鷲腸道細(xì)菌與腐食適應(yīng)性的關(guān)系。

腸道菌群作為近年來生命科學(xué)研究的熱點之一，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與宿主的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)存在相互調(diào)控，進(jìn)而與宿主的生理(發(fā)育、免疫穩(wěn)態(tài)、營養(yǎng)物質(zhì)代謝及維生素合成等)及眾多疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，甚至影響著宿主的情緒及行為[4-5]。關(guān)于鳥類，一系列的研究表明，腸道微生物從羽毛護(hù)理到卵的孵化等多個層面影響著鳥類宿主的生理過程[6]。我們利用16S rDNA高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，高山兀鷲的腸道菌群主要由梭桿菌屬(Fusobacterium)、狹義梭菌屬1(Clostridium-sensu-stricto-1)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、Epulopiscium屬和擬桿菌屬(Bacteroides)構(gòu)成，包含大量病原菌，也存在一定種類的有益菌(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。本研究利用M17培養(yǎng)基和乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(Lactobacillusselection media)對高山兀鷲新鮮糞便中的有益菌進(jìn)行分離與鑒定，并對獲得的菌種進(jìn)行耐藥性檢測、耐酸以及耐膽鹽測試、病原菌抑菌測定。研究結(jié)果有助于進(jìn)一步豐富我們對高山兀鷲可培養(yǎng)腸道微生物的認(rèn)識，還可為高山兀鷲對腐食適應(yīng)性機(jī)制的研究增添新內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 在青海省果洛藏族自治州甘德縣(北緯33.904 125°，東經(jīng)99.811 977°，海拔4 170 m)境內(nèi)，采集到野生高山兀鷲新鮮糞便數(shù)枚。將采集的新鮮糞便樣本放入車載冰箱中運回實驗室。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 Marker，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；鹽酸以及牛膽鹽，青海優(yōu)寧生物科技有限公司產(chǎn)品；M17和LBS(乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基)瓊脂以及M17和LBS肉湯，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌(EscherichiacoliATCC8099)、腸炎沙門氏菌(SalmonellaenteritidisCMCC 50041)以及金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC6538)，購自北京醫(yī)田生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌生理生化鑒定管，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 SW-CJ-1FD無菌超凈臺，KG-SX-500高壓滅菌鍋，NRY-2102C恒溫培養(yǎng)箱與搖床，ProFlex PCR儀，UV-3600Plus紫外可見分光光度計，牛津杯，PHS-3C型pH計，DYY-10C型核酸電泳儀，ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化 在無菌條件下，取高山兀鷲新鮮糞便樣本，放入1 mL無菌生理鹽水中，3 000 r/min離心5 min。取混勻后的懸液100 μL，在無菌水中按10-1～10-9梯度進(jìn)行10倍梯度稀釋。分別吸取其中10-1、10-3、10-5、10-7、10-9的稀釋液涂布在M17和LBS瓊脂培養(yǎng)基表面，在有氧條件下，培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h～ 48 h。然后挑取顏色、大小、形狀不同的單菌落于M17和LBS肉湯中，在有氧條件下37 ℃培養(yǎng)12 h。然后將M17和LBS肉湯中的菌液涂布到對應(yīng)的M17和LBS瓊脂培養(yǎng)基中，在有氧條件下進(jìn)行第2輪的純化培養(yǎng)。如此反復(fù)，經(jīng)過5輪后，最終獲取在M17和LBS瓊脂中純化的單一菌落。

1.2.2 16S rRNA基因的擴(kuò)增與鑒定 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟，提取細(xì)菌總DNA，利用細(xì)菌的16S rRNA基因通用擴(kuò)增引物對(上游引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 21 μL，總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃結(jié)束反應(yīng)。陽性對照，用實驗室保存的大腸埃希氏菌菌株的DNA作為模板；陰性對照，用ddH2O作為模板。分別取10 μL上述PCR產(chǎn)物，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，若檢測結(jié)果中出現(xiàn)約1 500 bp的條帶則為陽性。將上述PCR擴(kuò)增陽性的產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

將測序結(jié)果利用NCBI的Blast程序進(jìn)行序列同源性比對，找到同源性最高的序列，進(jìn)而確定細(xì)菌的分類水平。然后，將屬于同一種細(xì)菌的最長序列作為代表性序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫。運用MEGA X軟件，以Maximum composite likelihood模型計算遺傳距離，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)對上述提交至NCBI的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap自展1 000次檢驗進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)置信區(qū)間，以痰液彎曲菌(Campylobactersputorumstrain ATCC 33709)為外類群。

1.2.3 生化鑒定 挑取純培養(yǎng)的單菌落置于生理鹽水管中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)隙葹?.5，取0.5 mL菌液接種到細(xì)菌生理生化鑒定管中，放入培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h～38 h，判定結(jié)果。判定依據(jù)為《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》。

1.2.4 藥敏試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)，將麥?zhǔn)隙葹?.5的菌液均勻涂在瓊脂培養(yǎng)基上，貼上34種藥敏紙片，每一種類的藥敏紙片貼3片作為重復(fù)，放入培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)16 h后測量抑菌圈直徑，并依據(jù)抗菌藥物敏感性試驗的技術(shù)要求(WS/T 639-2018)判定結(jié)果。

1.2.5 生長曲線測定 將所分離的代表性菌株按5%體積比接種到LBS肉湯中，37 ℃進(jìn)行搖床培養(yǎng)。以無菌LBS肉湯為空白對照，每隔2 h，測定代表性菌株的OD 600 nm值，持續(xù)測定至28 h，每個菌株重復(fù)3次，取平均值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD 600 nm值為縱坐標(biāo)，繪制不同菌株的生長曲線。

1.2.6 耐酸試驗 按5%的體積比例接種所分離的代表性菌株到pH分別調(diào)為6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0的LBS肉湯中，37 ℃搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)14 h后測定OD 600 nm值。以正常LBS肉湯培養(yǎng)各菌株14 h的OD 600 nm值為對照，分析菌株在不同pH下的存活率，來判斷其耐酸性。

1.2.7 耐膽鹽試驗 在LBS肉湯中加入質(zhì)量體積比(m/V)分別為1、2、3、4、5 mg/mL的牛膽鹽溶液。將所分離的代表性菌株菌液按5%接種量接種至上述培養(yǎng)基中。37 ℃搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)14 h后測定OD 600 nm值，以正常LBS肉湯培養(yǎng)各菌株14 h的OD 600 nm值為對照，根據(jù)其在不同牛膽鹽濃度下的存活率，判斷其耐膽鹽能力。

1.2.8 抑菌試驗 利用牛津杯法測定所分離的代表性菌株對大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌3種病原菌的抑菌圈大小。超凈工作臺中，在LB(Luria-Bertani)瓊脂平板上加入50 μL病原菌菌液，并將菌液涂布均勻。在培養(yǎng)基表面等距離擺放牛津杯并輕輕按壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。在牛津杯中加入所分離的代表性菌株菌液各200 μL，培養(yǎng)24 h后，測定抑菌圈的大小。每種菌株做3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與純化

分別利用M17和LBS培養(yǎng)基，在有氧條件下，對高山兀鷲新鮮糞便樣本中的微生物進(jìn)行分離與純化。經(jīng)過5輪純化后，根據(jù)單菌落形狀、顏色和大小等特征的差異，最終獲得64個單菌落。其中，M17培養(yǎng)基挑選出33個單菌落，LBS培養(yǎng)基挑選處31個單菌落。

2.2 16S rRNA鑒定結(jié)果

對上述64個單菌落菌株提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因后，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。所有擴(kuò)增產(chǎn)物均在1 500 bp左右檢測到電泳條帶，與預(yù)期大小相符。經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司一代測序后，將所有測序結(jié)果利用NCBI的Blast程序進(jìn)行序列相似性比對，發(fā)現(xiàn)這些菌株隸屬于4個屬、6個種，分別是蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、簡單芽孢桿菌(Bacillussimplex)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和林地土壤芽孢桿菌(Solibacillussilvestris)。然后，將上述每個種的最長序列作為代表性序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號。上述6種細(xì)菌的登錄號分別為MW092227、MW092228、MW092226、MW092229、MW092514、MW092231。最后，用上述6個種的最長序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。

種名后為此種細(xì)菌16S rRNA登錄號；▲為本次分離的菌株；分枝上數(shù)字表示自展值為1 000時的置信度；標(biāo)尺為堿基替換率

2.3 分離菌的生化鑒定

對上述分離到的6種細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見表1。表1中的6種細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果與各自16S rRNA鑒定結(jié)果一致。

表1 分離菌株生化鑒定結(jié)果

2.4 分離菌的藥敏試驗

對上述6個種的代表性菌株進(jìn)行34種抗菌藥物的藥敏試驗(表2)。蠟樣芽孢桿菌對13種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。地衣芽孢桿菌對11種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。簡單芽孢桿菌對22種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。屎腸球菌對21種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。表皮葡萄球菌對9種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。林地土壤芽孢桿菌對20種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。由此可見，這6種菌株對9種～22種不等的抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。其中，簡單芽孢桿菌、屎腸球菌以及林地土壤芽孢桿菌可耐受高達(dá)20多種的抗菌藥物。表皮葡萄球菌、地衣芽孢桿菌以及蠟樣芽孢桿菌可耐受的抗菌藥物種類較少。進(jìn)一步從抗菌藥物抑制細(xì)菌的角度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)，有7種抗菌藥物能夠抑制本研究中分離到的5種～6種菌株，分別是哌拉西林、左氧氟沙星、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、諾氟沙星以及環(huán)丙氟哌酸。而氨曲南則對所有分離到的6種菌株均無抑制作用。

表2 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

2.5 生長曲線、耐酸、耐膽鹽的測定

對蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、簡單芽孢桿菌、屎腸球菌4種菌株的生長曲線、耐酸、耐膽鹽特征進(jìn)行測定。由圖2可知，4種菌株生長周期中潛伏期較短，僅2 h。2 h后開始進(jìn)入對數(shù)生長期，生長速度較快。屎腸球菌、蠟樣芽孢桿菌以及簡單芽孢桿菌在2 h～4 h時間段生長快速；6 h～18 h時間段生長速率緩慢，進(jìn)入穩(wěn)定期。地衣芽孢桿菌在2 h～16 h時間段快速生長；16 h后生長速率緩慢，進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖2 4種菌株的生長曲線

進(jìn)一步設(shè)置6個pH梯度和5個膽鹽梯度模擬胃腸道環(huán)境，測試這4種菌株的存活率。如圖3所示，4種菌株在pH為1～4時，存活率維持在20%左右，說明4種菌株在低pH環(huán)境中，生長受到抑制。但另一方面，在pH為1～2時，仍然能保持生長，說明4種菌株可以抵抗高山兀鷲胃酸環(huán)境，進(jìn)而進(jìn)入到腸道中實現(xiàn)定植。當(dāng)pH為5～6時，存活率明顯恢復(fù)，維持在60%以上。

圖3 4種菌株在不同pH下的存活率

續(xù)表2

不同膽鹽濃度下菌株的存活率如圖4所示。膽鹽濃度為5 mg/mL時，4種菌株存活率均在40%以上，說明具有良好的膽鹽耐受能力。當(dāng)膽鹽濃度降低至1 mg/mL時，屎腸球菌、地衣芽孢桿菌以及蠟樣芽孢桿菌存活率恢復(fù)至70%以上，而簡單芽孢桿菌存活率也恢復(fù)至60%左右。結(jié)果表明,4種菌株可以抵抗腸道中的膽鹽環(huán)境。

圖4 4種菌株在不同膽鹽濃度下的存活率

2.6 抑菌測定

4種分離菌株對大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果詳見表3。經(jīng)測定，4種分離菌株對對上述3種常見腸道致病菌均表現(xiàn)出一定的抑制效果，其中，屎腸球菌對大腸埃希氏菌的抑菌效果最好，簡單芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌與腸炎沙門氏菌的抑菌效果最好，但簡單芽孢桿菌對大腸埃希氏菌無抑菌性。

表3 4種分離菌株對大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌的抑制效應(yīng)

3 討論

關(guān)于食腐鷲類腸道微生物組的研究，有助于探究鷲類腐食適應(yīng)性的腸道微生物組新機(jī)制。我們課題組通過對不同類型的腐肉以及高山兀鷲腸道微生物進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)一定種類的有益菌存在于腐肉以及高山兀鷲腸道中，提示腐食以及高山兀鷲腸道并不是完全被病原菌占據(jù)。為了驗證這些有益菌是否具有輔助高山兀鷲宿主抵抗病原菌的能力，本研究對高山兀鷲腸道有益菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)與鑒定、耐藥性檢測、耐酸以及耐膽鹽測試、病原菌抑菌測定。分別利用M17培養(yǎng)基和乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基，共分離到64株細(xì)菌。根據(jù)16S rRNA以及生化鑒定結(jié)果，鑒定出6種細(xì)菌，隸屬于4個屬。

藥敏試驗結(jié)果顯示，這些菌株對9種～22種不等的抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。這些存在于高山兀鷲腸道內(nèi)的耐藥菌株，很可能來自于腐尸，尤其是家養(yǎng)動物的腐尸。青藏高原地區(qū)高山兀鷲的食物主要包括家牦牛、藏羊、馬、驢、狗等5種家養(yǎng)動物。推測獸藥的使用可能導(dǎo)致家養(yǎng)動物本身的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)一步通過腐食食物鏈傳遞給高山兀鷲等食腐動物。本研究選用的34種抗菌藥物，發(fā)現(xiàn)其中7種抗菌藥物能夠抑制本研究中分離到的5種～6種菌株，增加了對高山兀鷲菌株耐藥性的新認(rèn)識。

目前研究認(rèn)為，腸道有益菌與宿主在協(xié)同進(jìn)化過程中，形成互惠互利的共生關(guān)系，在維持腸道健康、促進(jìn)消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)、抵御病原菌侵襲、免疫機(jī)制調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[7]。經(jīng)抑菌試驗測定，本研究分離的4種潛在有益菌株(蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、屎腸球菌以及簡單芽孢桿菌)對常見腸道致病菌大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用。有研究表明蠟樣芽孢桿菌在腸道定植后，消耗大量氧氣進(jìn)而維持腸道厭氧環(huán)境，支持生理性厭氧菌大量增殖，從而抑制致病菌或條件致病菌[8]。此外，蠟樣芽孢桿菌在腸道中將淀粉轉(zhuǎn)化為單糖，再由其他菌種將單糖轉(zhuǎn)化為乳酸，降低腸道pH，從而起到抑制病原菌繁殖的作用[9]。地衣芽孢桿菌在生長代謝過程中產(chǎn)生蛋白多肽類物質(zhì)和大量溶菌酶，可直接抑制和殺傷病原菌[10]。屎腸球菌作為腸道共生菌，具有多種優(yōu)良生物學(xué)特性[11-12]，比如，可在腸道中通過定植抗力作用抑制病原菌黏附腸道，形成腸道屏障；代謝過程中產(chǎn)生乳酸、細(xì)菌素和過氧化氫等物質(zhì)，降低腸道pH，不利于病原菌生存；誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子、干擾素、白介素等，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫，提高抗病能力。簡單芽孢桿菌在生物防治中發(fā)揮重要作用，對植物具有促生長和拮抗病原菌的作用[13]。據(jù)此推測，這些有益菌可能發(fā)揮輔助高山兀鷲宿主抵抗病原菌的作用，進(jìn)而有助于高山兀鷲更好適應(yīng)腐食。未來，值得深入開展關(guān)于這些有益菌的代謝產(chǎn)物，尤其是抑菌活性物質(zhì)的分離鑒定工作。

可在酸性與較高濃度膽鹽的消化道環(huán)境中生存是有益菌在體內(nèi)存活與發(fā)揮生理功能的先決條件。耐酸、耐膽鹽試驗結(jié)果表明，上述4種潛在有益菌具有較好的耐酸、耐膽鹽特性，pH 1時，仍然能保持生長；膽鹽濃度5 mg/mL時，存活率均高于40%。這為進(jìn)一步將有益菌株轉(zhuǎn)入其他模式動物宿主進(jìn)行更加深入的生理功能研究奠定了基礎(chǔ)。