黃少隆，張翠惠，黃冬枚，郭文婷，鄭慶茹，周 湧

廣東省東莞市濱海灣中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523903

近年來(lái)，金黃色葡萄球菌的臨床檢出率逐年增加，在球菌檢出率中居第一位[1]。作為一種可導(dǎo)致人畜共患病的條件致病菌，其可通過(guò)分泌不同的毒力因子引發(fā)各類感染[2-3]。當(dāng)人體免疫力下降時(shí)，金黃色葡萄球菌更易引發(fā)人體各組織器官的化膿性炎癥，嚴(yán)重者甚至?xí)鹦膬?nèi)膜炎、腦膜炎以及敗血癥等致死性疾病[4-6]。另一方面，金黃色葡萄球菌極易定殖于女性生殖道內(nèi)，是近年來(lái)女性細(xì)菌性陰道炎、盆腔炎發(fā)病率升高的主要原因，并且對(duì)處于妊娠期的女性患者而言，金黃色葡萄球菌的感染甚至?xí)?dǎo)致新生兒早產(chǎn)以及妊娠流產(chǎn)[7]。目前，耐藥金黃色葡萄球菌廣泛存在，對(duì)感染的患者而言，除正確運(yùn)用抗菌藥物外，對(duì)患處進(jìn)行正確的消毒及有效的沖洗也起著十分重要的作用，因此，進(jìn)一步探討當(dāng)前市面上常見的抗菌洗液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用具有重要意義[8-9]。本課題組選取了4種不同抗菌機(jī)制的洗液進(jìn)行研究，旨在為臨床后期應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌ATCC43300。

1.2試劑與儀器 4種洗液均購(gòu)于廣東省東莞國(guó)藥集團(tuán)有限公司，其主要成分如下：A是由納米銀顆粒為主要成分組成的抗菌洗液；B是由苦參、冰片、黃柏為主要成分組成的中藥制劑；C是以葡萄柚種子為基本原料所提取的一種新型植物抗菌劑；D是由蛇床子、蒼術(shù)、薄荷、苦參以及金銀花為主要成分組成的中藥制劑。腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測(cè)試劑盒(ELISA)購(gòu)于康朗生物科技有限公司；單核巨噬細(xì)胞系購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于普賽諾生命科技有限公司；VITEX比濁儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；酶標(biāo)儀購(gòu)于普朗公司；電子天平購(gòu)自衡平儀器儀表有限公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自普美達(dá)公司。

1.3方法

1.3.1不同抗菌洗液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的肉湯微量稀釋法，將A、B、C、D抗菌洗液按梯度稀釋后，分別添加到無(wú)菌的96孔板中，其中第1孔至第11孔分別加入稀釋好的不同濃度的抗菌洗液10 μL，第12孔加入等量的滅菌水作為陰性對(duì)照。4種抗菌洗液第1孔到第11孔各藥物濃度分別為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.20、3.10、1.50、0.75、0.37、0.18 mg/mL。將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)復(fù)蘇，并放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過(guò)麥?zhǔn)媳葷岱ǘ?，制備濃度?.5×108CFU/mL的菌懸液，即0.5麥?zhǔn)蠞岫?。用MH肉湯稀釋1 000倍后，每孔中加入100 μL菌懸液，蓋上蓋子后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后判斷結(jié)果，同時(shí)測(cè)定每孔菌液600 nm處吸光度(A600)值。以首先出現(xiàn)完全抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的小孔藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。用含有0.5及1倍MIC的抗菌洗液的培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌24 h，分別于0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、24.0 h取對(duì)應(yīng)菌液10 μL涂布于MH平板，以孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌落數(shù)為縱坐標(biāo)繪制抑菌曲線。

1.3.2金黃色葡萄球菌在不同抗菌洗液作用后對(duì)紫外吸收物質(zhì)滲透量檢測(cè) 用含有0.5以及1倍MIC的抗菌洗液的培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，在菌液與藥液混合后，金黃色葡萄球菌的終濃度為1.5×105CFU/mL，抗菌洗液終濃度分別為0.5以及1倍MIC。分別于0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后取相應(yīng)菌液5 000 r/min下離心15 min，再經(jīng)0.2 μm的濾膜過(guò)濾上清液后在260 nm下測(cè)定懸浮液吸光度(A260)值，以純凈水替代抗菌洗液作用后的菌體懸浮液作空白對(duì)照。時(shí)間為橫坐標(biāo)，以A260值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.3.3TNF-α的檢測(cè) 將人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞放置于RPMI-1640培養(yǎng)基中在37 ℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，按規(guī)定時(shí)間更換培養(yǎng)液。誘導(dǎo)分化THP-1細(xì)胞后加入事先配制好濃度的A、B、C、D抗菌洗液預(yù)處理2 h，棄掉上清液后分別向其中加入2×106CFU/mL金黃色葡萄球菌的菌懸液，刺激12 h后，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心以收集細(xì)胞培養(yǎng)液，隨后使用TNF-α檢測(cè)試劑盒(ELISA)測(cè)定TNF-α水平。將不受抗菌洗液與金黃色葡萄球作用的THP-1細(xì)胞設(shè)置為空白對(duì)照組E。將只受金黃色葡萄球菌作用的THP-1細(xì)胞設(shè)置為陰性對(duì)照組SA。

2 結(jié) 果

2.1不同抗菌洗液處理后金黃色葡萄球菌的MIC B、D洗液的MIC為第6孔，即MIC=6.20 mg/mL。A、C的MIC為第7個(gè)孔，即MIC=3.10 mg/mL。不同抗菌洗液處理后的金黃色葡萄球菌的A260值見表1。1倍MIC與0.5倍MIC下的抑菌曲線見圖1、2。

表1 不同濃度抗菌洗液處理后的金黃色葡萄球菌的A600值

圖1 金黃色葡萄球菌在1倍MIC下的抑菌曲線

圖2 金黃色葡萄球菌在0.5倍MIC下的抑菌曲線

2.2金黃色葡萄球菌在不同抗菌洗液作用后的A260檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，4種抗菌洗液對(duì)金黃色葡萄球菌作用后，其A260值與抗菌洗液的濃度成正比，濃度越高，A260值越高。見圖3、4。

圖3 1倍MIC下金黃色葡萄球菌的A260值

圖4 0.5倍MIC下金黃色葡萄球菌的A260值

2.3不同抗菌洗液作用THP-1細(xì)胞后分泌TNF-α水平的比較 不同抗菌洗液作用THP-1細(xì)胞后均產(chǎn)生抑制作用，且抑制效果呈濃度依賴關(guān)系，抑制效果分別為A>C>B>D，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、6。

圖5 1倍MIC下對(duì)金黃色葡萄球菌刺激后THP-1細(xì)胞分泌TNF-α水平

圖6 0.5倍MIC對(duì)金黃色葡萄球菌刺激后THP-1細(xì)胞分泌TNF-α水平

3 討 論

本研究通過(guò)分析4種抗菌洗液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)、細(xì)胞質(zhì)膜完整性和刺激TNF-α分泌3個(gè)方面的影響作用，證實(shí)了這4種抗菌洗液對(duì)金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌效果。其中，A與C洗液抑菌效果優(yōu)于另外兩種，MIC為3.10 mg/mL，主要原因?yàn)榭咕鷻C(jī)制不同。

A洗液是一類新型抗菌劑，通過(guò)納米銀顆粒直接進(jìn)入菌體內(nèi)部，通過(guò)與代謝蛋白酶結(jié)合，使菌體窒息死亡，具有抑菌殺菌作用強(qiáng)大、抗耐藥性及作用持久等優(yōu)點(diǎn)，具有傳統(tǒng)無(wú)機(jī)抗菌劑無(wú)法比擬的抗菌效果[10]。但是，此類洗液對(duì)使用及保存要求較高，金屬銀過(guò)敏者禁用，且切勿入口，需存放于避光、干燥、通風(fēng)處，以免失效。C洗液主要為葡萄柚種子提取物，是一種高效無(wú)毒的抗菌劑，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于各種污染手術(shù)的沖洗中，可有效預(yù)防術(shù)后感染。有研究表明，葡萄柚種子提取物還具有調(diào)節(jié)菌群生態(tài)平衡，調(diào)節(jié)女性陰道內(nèi)酸堿度平衡的功效，其主要通過(guò)促進(jìn)女性陰道內(nèi)活性氧的吸收，調(diào)節(jié)陰道內(nèi)細(xì)菌的增殖，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)消炎滅菌的目的[11]。目前市面上此類抗菌洗液的品牌比較少，還未被大眾廣泛應(yīng)用。B配方中主要含苦參、冰片、黃柏等中藥成分，性質(zhì)溫和，常用于會(huì)陰部位的日常清潔。同時(shí)還具有活血化瘀、減輕傷口疼痛感以及促進(jìn)傷口恢復(fù)等特點(diǎn)[12]，可用于女性會(huì)陰傷口護(hù)理。D洗液主要由蛇床子、蒼術(shù)、薄荷、苦參以及金銀花等成分組成，主治女性濕熱帶下，如陰部瘙癢紅腫，白帶量多，色黃或如豆渣狀，口苦口干，尿黃便結(jié)，對(duì)于霉菌性、滴蟲性陰道炎有清熱燥濕以及止癢的效果，更適合女性婦科炎癥常規(guī)使用[13-14]。

金黃色葡萄球菌生存及感染均基于菌體的完整性，在自然環(huán)境中，細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)膜可以阻擋內(nèi)容物的泄漏同時(shí)吸取養(yǎng)分，形成一個(gè)特殊的生物屏障，既保障了滲透壓的穩(wěn)定也在一定程度上阻擋外界有害因素的侵?jǐn)_，是極為重要的組成部分。當(dāng)屏障受損時(shí)，細(xì)胞內(nèi)容物才會(huì)發(fā)生泄漏，最初是相對(duì)分子質(zhì)量比較小的一些無(wú)機(jī)鹽和微量元素，其次是一些大分子，如蛋白質(zhì)及核酸。在260 nm處，B及D洗液的A值明顯低于其他兩種洗液，說(shuō)明其對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的破壞作用較小，這可能由于中藥復(fù)方類型的洗液性質(zhì)溫和，沒(méi)有直接作用破壞細(xì)胞膜的靶點(diǎn)。

4類抗菌洗液均可抑制TNF-α水平的分泌且與濃度相關(guān)，A洗液抑制效果最好，而D最差。這可能與納米銀顆粒相對(duì)分子質(zhì)量較小可以更快進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，與相關(guān)的酶結(jié)合使其失活有關(guān)。C作用僅次于A洗液，可能與C的主要成分也是小分子物質(zhì)，比其他兩種藥物更易滲入細(xì)胞有關(guān)。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)D洗液的抑菌效果較差，其他3種洗液按照抑菌效果從高到低分別為A>C>B。但是，A洗液價(jià)格較為昂貴，使用及保存要求高，所以在生活中未能廣泛使用。同時(shí)，本研究證明C洗液也具有良好的抗菌效果，價(jià)格適中，但國(guó)內(nèi)商品化的產(chǎn)品較少，選擇性低，不為大眾所熟知，可在人們?nèi)粘Ｉ钪型茝V使用。中藥配伍洗液因殺菌譜較廣以及可減少細(xì)胞耐藥性等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用。沈煒等[15]研究發(fā)現(xiàn)中藥“婦洗液”治療育齡期女性陰道炎的療效顯著，且療效明顯優(yōu)于克癢舒洗液。

本研究亦存在一些不足。首先，金黃色葡萄球菌毒力因子的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，本試驗(yàn)雖研究4種抗菌洗液對(duì)抑制TNF-α水平的影響，但卻并未探討其對(duì)金黃色葡萄球菌的基因表達(dá)及彼此之間的關(guān)系及具體影響機(jī)制，后期有待進(jìn)一步研究。