赫昊， 王雪峰， 張秀英， 黃婉怡， 王爽

流感是影響人類健康的常見傳染病之一。流感病毒其抗原變異性強(qiáng)，傳播迅速，每年可引起季節(jié)性流行，在人群聚集機(jī)構(gòu)易發(fā)生爆發(fā)疫情。肺炎鏈球菌是一種革蘭陽(yáng)性厭氧菌，在正常人的口腔及鼻咽部經(jīng)常存在，只形成帶菌狀態(tài)，通常不致病，在免疫力低下，嬰幼兒、年老體弱者易發(fā)生肺部感染。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自16世紀(jì)以來，全球性的“大流感”至少爆發(fā)過30次。一百年前的1918年流感是第一次世界范圍傳播的流感，據(jù)保守估計(jì)造成了全球約5 000萬(wàn)人死亡。據(jù)推算，全球每年有300萬(wàn)人因流感感染住院，25萬(wàn)人死亡[1]。盡管抗菌藥物、流感疫苗早已問世，肺炎鏈球菌疫苗投入使用也已10余年，但是流感流行期間，其繼發(fā)的細(xì)菌感染仍可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，甚至在世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的死亡率和發(fā)病率[2]。流感與細(xì)菌混合感染病情復(fù)雜，機(jī)制混亂，因此成功構(gòu)建流感病毒與肺炎鏈球菌混合感染動(dòng)物模型對(duì)明確共感染的免疫應(yīng)答機(jī)制及探索正確治療順序是及其重要的環(huán)節(jié)。本文主要對(duì)構(gòu)建共感染模型動(dòng)物的選擇、病原測(cè)定、造模時(shí)間選擇等過程方法進(jìn)行綜述，以期為今后的相關(guān)科學(xué)研究做好鋪墊。

1 流感病毒與肺炎鏈球菌共感染現(xiàn)狀

研究表明，在過去100年的4次流感大流行期間，50%～90%的嚴(yán)重或致死性流感病毒感染與細(xì)菌感染有關(guān)[3-6]。據(jù)報(bào)道，至少有15種能合并流感病毒感染的細(xì)菌。其中至少4種類型的細(xì)菌包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺軍團(tuán)菌和流感嗜血桿菌增加了肺炎的風(fēng)險(xiǎn)和隨后的死亡率[7-10]。

流感病毒與肺炎鏈球菌的共同感染存在多種因素可導(dǎo)致肺炎[11-14]。與單一感染相比，流感病毒感染后，低劑量的肺炎鏈球菌即可造成嚴(yán)重感染[15]。有研究證實(shí)，共感染期間TH17免疫應(yīng)答受到抑制、自然殺傷細(xì)胞功能受限、營(yíng)養(yǎng)因素、宿主自身因素等都會(huì)改變宿主的免疫反應(yīng)或肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而阻礙病毒細(xì)菌清除[16-19]。

2 模型研究

2.1 動(dòng)物種類 根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)記載，目前共感染模型普遍選擇小鼠，常用類型為BALB/c、CBA/J、C57BL/6三種。性別選擇雌雄均可，鼠齡6～12周。有研究結(jié)果表明，滴鼻感染流感病毒PR8可引起小鼠在急性期體質(zhì)量下降，肌肉酸痛，活動(dòng)性降低，伴隨明顯的抑郁焦慮情緒；且BALB/c小鼠對(duì)流感病毒PR8的敏感度較C57BL/6小鼠明顯，更適宜做流感病毒PR8感染的小鼠[20]。另外雌性小鼠有動(dòng)情周期，激素水平可能會(huì)影響行為[21]。

2.2 病原種類的選擇

2.2.1 流感病毒 流感病毒通常選用流感病毒A/PR/8/34(H1N1)。流感病毒持續(xù)進(jìn)化，不斷出現(xiàn)新的亞型。有研究表明，流感病毒A/PR/8/34(H1N1)是一種高致病性的小鼠適應(yīng)病毒，肺炎鏈球菌可以黏附在氣管內(nèi)暴露的部分基底膜上，此型流感可與細(xì)菌共同孵育[22]。

2.2.2 肺炎鏈球菌 肺炎鏈球菌的選擇以普遍流行為原則。肺炎鏈球菌可根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，分為90多種血清型。在中國(guó)，19群肺炎鏈球菌(主要為19F和19A)一直是兒童中最為流行的血清群，其他較為流行的血清型為6B、14和23F[23-25]。

2.3 病原滴度的測(cè)定

2.3.1 流感病毒的測(cè)定 流感病毒的滴度測(cè)定一般有兩種常用方法，半數(shù)組織感染量(TCID50)[26]和空斑分析。空斑分析是檢測(cè)病毒感染顆粒滴度的一種常用方法。感染性滴度的單位一般表示為PFU/mL，其中PFU(plaque forming unit)表示空斑形成單位。空斑分析的優(yōu)勢(shì)在于可以直接用肉眼看到一個(gè)一個(gè)空斑，但是它的重復(fù)性比較差。TCID50基于泊松分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，所得結(jié)果更穩(wěn)定。

2.3.2 肺炎鏈球菌的測(cè)定 肺炎鏈球菌的計(jì)數(shù)方法一般有兩種方法：平板菌落計(jì)數(shù)法和麥?zhǔn)媳葷岱?。平板菌落?jì)數(shù)法[27]是取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)，以CFU為單位。此法靈敏度高，目前在國(guó)際上廣泛應(yīng)用。麥?zhǔn)媳葷岱ㄊ歉鶕?jù)菌懸液的透光量間接地測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量，可用光電比色計(jì)測(cè)定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。此法簡(jiǎn)便快捷，但只能檢測(cè)含有大量細(xì)菌的懸浮液，得出相對(duì)的細(xì)菌數(shù)目。

2.4 造模方法

2.4.1 流感病毒感染后與肺炎鏈球菌混合感染 流感病毒感染后2～3日，病毒滴度達(dá)到高峰，隨后接種肺炎鏈球菌。在流感病毒與細(xì)菌感染的重癥肺炎的免疫動(dòng)力學(xué)研究中，選擇在分組后先對(duì)小鼠接種流感病毒，按50 μg/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，直立狀態(tài)下經(jīng)鼻接種1×104PFU/mL流感病毒50 μL，混合感染組2日后經(jīng)鼻接種1×108CFU/mL肺炎鏈球菌50 μL，隨后分析小鼠肺中病毒滴度、細(xì)菌數(shù)量和免疫反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，如細(xì)胞因子和趨化因子。一些關(guān)鍵免疫介質(zhì)，包括Toll樣受體/絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)、環(huán)氧合酶表達(dá)和前列腺素E2的產(chǎn)生[26]。有學(xué)者在實(shí)驗(yàn)中通過流感病毒感染后3 d接種肺炎鏈球菌，來探索顆粒蛋白前體調(diào)控流感病毒感染后小鼠對(duì)細(xì)菌易感性的機(jī)制[28]。

2.4.2 流感病毒感染恢復(fù)后繼發(fā)肺炎鏈球菌感染 在流感病毒感染后增強(qiáng)對(duì)肺炎鏈球菌易感性的研究中，小鼠用異氟醚吸入麻醉，流感組小鼠滴鼻接種10 TCID50流感病毒，空白組接種磷酸鹽緩沖液50 μL為對(duì)照，接種流感病毒14 d后，通過實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定小鼠體內(nèi)流感病毒清除干凈，14 d后滴鼻接種1×104CFU/mL肺炎鏈球菌50 μL。從流感病毒感染中恢復(fù)過來的小鼠對(duì)隨后的肺炎鏈球菌高度敏感，實(shí)驗(yàn)組小鼠致死率較對(duì)照組大大增加，流感恢復(fù)期小鼠肺組織白細(xì)胞介素-10比對(duì)照組高50倍。接種前用抗白細(xì)胞介素-10單抗處理，可使繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎的細(xì)菌生長(zhǎng)減少，致死率明顯降低[29]。

2.4.3 肺炎鏈球菌感染后與流感病毒混合感染 此種造模順序用于致死性研究。麻醉狀態(tài)下的小鼠滴鼻5×105CFU/mL肺炎鏈球菌致死劑量100 μL(50 μL/鼻孔)，7 d后滴鼻相同劑量流感病毒致死劑量3 000 TCID50。研究表明流感病毒和肺炎球菌雙重感染小鼠模型中存在協(xié)同死亡率，肺炎鏈球菌攻擊后發(fā)生100%致死率流感病毒感染需7 d。盡管在第3天和第5天組中也觀察到了100%的死亡率，但第7天的死亡最快，發(fā)生在24 h內(nèi)。在所有小鼠中，第3天接受流感病毒感染的小組，平均生存期為3.3 d，在第5天接受感染的小組，平均生存期為2.5 d。第21天失去了協(xié)同作用。這些數(shù)據(jù)表明必須有一定時(shí)間序列的事件才能發(fā)生協(xié)同殺傷力，揭示在此模型中，肺炎球菌感染后7 d感染了流感病毒以最快，最徹底的死亡率死亡[15]。

2.5 模型鑒定

2.5.1 一般狀態(tài) 接種病原后，小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，精神萎靡、進(jìn)食減少、活動(dòng)量減少及毛發(fā)立起等狀態(tài)[30]，臨床中，流感病毒感染除引發(fā)呼吸道癥狀外，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成流感相關(guān)腦癥綜合征，研究中小鼠還會(huì)出現(xiàn)自發(fā)行為改變，伴隨抑郁、焦慮、緊張等情緒[20]。

2.5.2 肺葉中病原滴度測(cè)定 處死小鼠后，在無(wú)菌條件下取出肺，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液在肺中洗滌3次，肺同源物直接用于細(xì)菌培養(yǎng)(可離心)，上清液用于定量肺炎球菌菌落計(jì)數(shù)，肺炎球菌的鑒定通過目視檢查和標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別菌落形態(tài)來完成[15]。流感病毒的鑒定可應(yīng)用克隆測(cè)序基因比對(duì)方法結(jié)合反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)病毒載量檢測(cè)[31]。

2.5.3 肺部病理切片 肺部改變通常涉及肺氣道或肺實(shí)質(zhì)。肺部切除后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，并在顯微鏡下檢查病理學(xué)改變。氣道改變主要見于感染病毒的小鼠，管腔、黏膜上皮壞死或過度增生。多發(fā)性實(shí)質(zhì)性灶伴肺泡發(fā)炎，肺泡上皮細(xì)胞肥大和增生，肺泡壞死和纖維蛋白沉積[15]。

3 討論

一直以來，流感的爆發(fā)是威脅世界衛(wèi)生的主要因素，而流感后繼發(fā)細(xì)菌感染更是提高了肺炎致死率，其中以兒童、老人及體弱者尤為易感。流感病毒不僅嚴(yán)重危害了畜禽養(yǎng)殖業(yè)，并且對(duì)公共衛(wèi)生安全具有巨大的潛在威脅。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，2013年H7N9流感病毒爆發(fā)以來，目前已經(jīng)造成1 567例人感染，其中死亡615人，致死率高達(dá)39.2%[32]。肺炎鏈球菌是引起繼發(fā)性肺炎的主要病原體。中醫(yī)在共感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，共感染模型動(dòng)物可以選用BALB/c、CBA/J、C57BL/6小鼠，流感病毒則最宜采用流感病毒A/PR/8/34(H1N1)，病毒滴度的測(cè)定可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件和實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化選擇，常用方法為TCID50和空斑實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌計(jì)數(shù)常用平板計(jì)數(shù)和麥?zhǔn)媳葷岱?。共感染造模方式為麻醉后滴鼻接種，接種時(shí)間的確定則根據(jù)研究目的而選擇。近幾年，有實(shí)驗(yàn)采用氣管造模的方法，在霧霾環(huán)境下進(jìn)行IV感染，在采用PM2.5氣管滴注聯(lián)合IV感染對(duì)小鼠進(jìn)行造模后，其成模的顯著性高于單一IV感染[33]。造模將小鼠深度麻醉后懸吊，從前切牙成60°～70°，將一根鈍頭彎曲的18 g針頭插入氣管，懸浮于隆突上方，直接向肺中注入50 μL感染液。然后將小鼠的鼻孔阻塞，直到觀察到大喘氣[34]。此種方法研究結(jié)果更加準(zhǔn)確，但難度較大，需要實(shí)驗(yàn)人員熟練的技術(shù)配合。實(shí)驗(yàn)中要注意病原劑量、小鼠致死率等問題。目前，國(guó)內(nèi)外共感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少，還需要通過大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證最優(yōu)模型,同時(shí)有利于其他合并病原感染的研究，腺病毒與支原體等感染同樣是兒童常見重癥肺炎的原因[35]。流感和細(xì)菌共感染發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，致死率高，成功構(gòu)建共感染模型將為明確共感染發(fā)病機(jī)制、預(yù)防、治療重癥流感打下基礎(chǔ)。