李達(dá)，孫慕白，苗欣宇，牛紅紅，孫瑞悅，王景會(huì)*

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長(zhǎng)春 130033；2.延邊大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 延吉 133002)

淀粉酶是工業(yè)上重要的酶，約占世界酶市場(chǎng)的65%[1]。其中食品工業(yè)應(yīng)用最為廣泛的α-淀粉酶主要用于水解淀粉制造葡萄糖[2]等糖類原料，以及生產(chǎn)糊精[3]、醋[4]、果汁[5]和味精等調(diào)味料，還用于面包等面制品生產(chǎn)品質(zhì)改良劑[6]、食品原料澄清工藝[7]等加工業(yè)，是一種潛在價(jià)值極高的食品用酶[8]?？莶菅挎邨U菌因其菌種可靠性、易于操作和生產(chǎn)成本低廉的大規(guī)模生產(chǎn)工藝等特點(diǎn)被用于淀粉酶的商業(yè)生產(chǎn)[9]。

微生物生產(chǎn)酶類的關(guān)鍵因素之一是獲得高產(chǎn)能(單位時(shí)間內(nèi)單位體積形成的酶類產(chǎn)品數(shù)量)。微生物高密度生產(chǎn)酶類培養(yǎng)技術(shù)主要核心在于提高生產(chǎn)率，該技術(shù)還有其他優(yōu)點(diǎn)，如減少培養(yǎng)體積，減少?gòu)U水，減少設(shè)備投資和加強(qiáng)下游處理。優(yōu)化發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)組成成分是獲得高密度生產(chǎn)酶類最常用的技術(shù)之一[10]。培養(yǎng)基中常見的必需營(yíng)養(yǎng)素來源是碳、氫、氮、氧和磷。微生物通常以有機(jī)形式吸收碳。有機(jī)碳通常是生物的產(chǎn)物[11]。氮的另一種基本營(yíng)養(yǎng)素是蛋白質(zhì)、DNA、RNA和ATP結(jié)構(gòu)的一部分。氮對(duì)異養(yǎng)生物的生存非常重要，但必須降解成氨基酸等基本成分才能使用[12]。無機(jī)鹽是細(xì)胞生命物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)移的重要參與者。沒有足夠的無機(jī)鹽，生物就會(huì)停止生長(zhǎng)[13]。因此，適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境是微生物高濃度生產(chǎn)酶類的必要條件，也是生產(chǎn)工藝調(diào)控的重要手段之一。

先前對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵的研究發(fā)現(xiàn)，包括碳源、氮源和無機(jī)鹽在內(nèi)的培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)成分是影響細(xì)胞生酶的主要因素，而響應(yīng)面法(RSM)是優(yōu)化枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶量的有效策略。與傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)分析優(yōu)化方法相比，RSM是一種省時(shí)、省力的方法，主要有中心組合設(shè)計(jì)(CCD)、Box-Benhnken(BBD)、單因素設(shè)計(jì)、優(yōu)化設(shè)計(jì)、用戶定義設(shè)計(jì)和歷史數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)。RSM已成功用于許多產(chǎn)品的生產(chǎn)優(yōu)化，包括酶、抗生素和生物燃料。在這項(xiàng)研究中，我們使用RSM和BBD來優(yōu)化枯草芽孢桿菌CGMCC5174發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)成分組成配方，以提高微生物活產(chǎn)酶量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌CGMCC5174：由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品微生物團(tuán)隊(duì)提供。

葡萄糖、甘油、麥芽糖、甘露醇、棉子糖、山梨糖醇、淀粉、蔗糖、木糖、(NH4)2SO4、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、尿素、鹽酸、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、硫酸錳(MnSO4)、硫酸鎂(MgSO4)和氯化鈣(CaCl2)：均為分析純,上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；糖蜜(食品級(jí))：購(gòu)于山東傳承化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Olympus生物顯微系統(tǒng) 日本Olympus公司；PB-10型酸度計(jì) 德國(guó)賽多利斯公司；MLS-3780高壓滅菌器 日本Sanyo公司；HZQ-Q振蕩培養(yǎng)箱、BCN-1360B 型無菌超凈工作臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DP-756P分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌CGMCC5174基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件

枯草芽孢桿菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、氯化鈉5 g/L，使用去離子水定容到1 L，搖動(dòng)容器使物料全部溶解后，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為7.4，放置高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌15 min。

在培養(yǎng)過程中，控制液體培養(yǎng)基初始pH值為7.4，裝液量為50 mL/250 mL，接種量為3.5 mL/dL，放入振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間14 h后開展后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 發(fā)酵液粗酶產(chǎn)品的制備

取發(fā)酵完畢的枯草芽孢桿菌CGMCC5174發(fā)酵液，4500 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，添加(NH4)2SO4至溶液飽和度為85%，4 ℃冷藏保存12 h，9000 r/min離心30 min，取底部沉淀放于pH 6.0的磷酸緩沖液中，使用截留分子量7～1.4 kDa的透析袋在4 ℃冷藏溫度下透析16 h，將透析液冷凍干燥后，得到枯草芽孢桿菌CGMCC5174粗酶粉。

1.3.3 淀粉酶活力測(cè)定方法[14]

采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24401-2009的測(cè)定方法，略作改動(dòng)。

稱取上述制得的粗酶凍干粉末1 g，用pH 6.0的磷酸緩沖液充分溶解，定容至100 mL，配制20 g/L可溶性淀粉溶液后，取出20 mL放于比色管中，加入磷酸緩沖液(pH 6.0)5 mL，放于振蕩器振蕩5 min，置于60 ℃水浴鍋中恒溫預(yù)熱10 min。加入1 mL稀釋好倍數(shù)的待測(cè)酶液，迅速搖勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)反應(yīng)5 min。吸取1 mL反應(yīng)液迅速加入預(yù)先裝有0.5 mL鹽酸溶液(0.1 mol/L)和5 mL稀碘液的比色管中，快速振蕩搖勻，以0.5 mL鹽酸溶液(0.1 mol/L)和5 mL稀碘液混合液為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)在660 nm波長(zhǎng)下，使用10 mm比色皿測(cè)定吸光度(A)。按照GB/T 24401-2009附錄A(吸光度與測(cè)試α-淀粉酶濃度對(duì)照表)，根據(jù)吸光度值，計(jì)算待測(cè)液中酶類的濃度。

根據(jù)下式計(jì)算得到枯草芽孢桿菌CGMCC5174粗酶粉中α-淀粉酶酶活(c)。

X=c×n。

式中：X為枯草芽孢桿菌粗酶粉酶活力(U/g)；c為待測(cè)液中的酶活力(U/g)；n為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基碳源及添加量?jī)?yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的選擇根據(jù)前期參考文獻(xiàn)[15]中條件選擇葡萄糖、甘油、麥芽糖、甘露醇、棉子糖、山梨糖醇、淀粉、蔗糖、木糖、糖蜜。以枯草芽孢桿菌CGMCC5174基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件發(fā)酵液為對(duì)照，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活力。

選擇發(fā)酵液中酶活力最高的碳源為最佳碳源，改變液體培養(yǎng)基碳源添加量為5，10，15，20，25，30 g/L，培養(yǎng)基其他成分保待不變，發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的酶活力。

1.3.5 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基氮源及添加量?jī)?yōu)化

以上述碳源優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的選擇根據(jù)前期參考文獻(xiàn)[16]中條件選擇大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、尿素、硫酸銨，氮源添加量為15 g/L。以枯草芽孢桿菌CGMCC5174基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件發(fā)酵液為對(duì)照，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活力。

選擇相互不顯著、較優(yōu)的幾種氮源做氮源比例復(fù)合試驗(yàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基其他營(yíng)養(yǎng)成分條件不變，發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定枯草芽孢桿菌的酶活力。以優(yōu)化比例的氮源為研究對(duì)象，發(fā)酵培養(yǎng)液其他營(yíng)養(yǎng)成分不變，氮源總量分別為5，10，15，20，25，30 g/L，發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定枯草芽孢桿菌的酶活力。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)液無機(jī)鹽的優(yōu)化

以上述碳源和氮源優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，無機(jī)鹽分別只添加磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸錳(MnSO4)、硫酸鎂(MgSO4)和氯化鈣(CaCl2)中的一種，添加量為5 g/L，發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定枯草芽孢桿菌的酶活力。

1.3.7 發(fā)酵培養(yǎng)基成分Plackett-Burman設(shè)計(jì)

根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，用Minitab 19.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出對(duì)枯草芽孢桿菌酶活力影響比較顯著的因素，發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定枯草芽孢桿菌的酶活力。

1.3.8 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化成分最陡爬坡試驗(yàn)

以上述篩選出的顯著性因素為試驗(yàn)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步確定培養(yǎng)基組成成分，通過最陡爬坡試驗(yàn)確定篩選出的顯著性試驗(yàn)因素最佳使用區(qū)域。根據(jù)試驗(yàn)顯著性正負(fù)效應(yīng)，設(shè)計(jì)各個(gè)試驗(yàn)因素的合理步長(zhǎng)，增加合理試驗(yàn)因素密集度，接近試驗(yàn)結(jié)果理論上的最佳區(qū)域。發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定枯草芽孢桿菌以枯草芽孢桿菌CGMCC5174基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件發(fā)酵液為對(duì)照，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活力。

1.3.9 發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面分析統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)法通過合理地選取試驗(yàn)因素?cái)?shù)據(jù)點(diǎn)和試驗(yàn)因素選擇迭代策略，克服了傳統(tǒng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)方法的缺點(diǎn)，在對(duì)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基成分優(yōu)化選擇過程中取得了快速的效果[17]。采用Minitab 19.0軟件根據(jù)上述優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)，通過方差分析，依據(jù)二次多項(xiàng)式回歸方程繪制試驗(yàn)結(jié)果響應(yīng)面分析法三維立體分析圖形，通過數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分理論最佳配方，并通過實(shí)際試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基碳源及添加量?jī)?yōu)化

由圖1中A可知，當(dāng)發(fā)酵液的碳源是糖蜜時(shí)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活最高，其次是葡萄糖和蔗糖。糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，其成分隨著不同的糖原料和加工條件的變化而變化，主要含有大量的可發(fā)酵糖和生長(zhǎng)刺激因子。不但能滿足枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)需求，還能刺激細(xì)菌大量分泌代謝產(chǎn)物[18]。其他單一碳源也能滿足細(xì)菌生長(zhǎng)的需要，但效果與糖蜜發(fā)酵明顯不同，因此選擇糖蜜作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖1 碳源種類(A)及碳源添加量(B)對(duì)發(fā)酵液酶活的影響

由圖1中B可知，當(dāng)碳源添加量為15 g/L時(shí)，發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活最高，當(dāng)碳源濃度過低時(shí)，微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，造成發(fā)酵液中活菌分泌酶類產(chǎn)量較低。但碳源濃度過高時(shí)，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)反而抑制了菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的分泌；也可能與發(fā)酵液的整體黏度增大，影響到微生物生長(zhǎng)過程中氧成分的吸收，導(dǎo)致活菌量降低，淀粉酶含量降低，故選擇碳源添加量為15 g/L。

2.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基氮源及添加量?jī)?yōu)化

氮源是微生物生長(zhǎng)繁殖必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素，是微生物合成細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的主要成分。因此，生長(zhǎng)和培養(yǎng)環(huán)境中氮源的類型和數(shù)量對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)及生產(chǎn)代謝產(chǎn)物非常重要。由圖2中A可知，使用不同氮源的菌株的產(chǎn)酶活力明顯不同。試驗(yàn)中觀察到有機(jī)氮源比無機(jī)氮源對(duì)枯草芽孢桿菌的生物合成代謝有明顯的促進(jìn)作用。因此，選擇酵母粉和胰蛋白胨進(jìn)行復(fù)合氮源配比試驗(yàn)。由圖2中B可知，在上述兩個(gè)重要因素結(jié)合后，菌株的產(chǎn)酶活力增加,但選擇比例之間并無顯著差異。因此，考慮到生產(chǎn)成本，選擇了復(fù)合有機(jī)氮比例和胰蛋白胨∶酵母粉為1∶2。

圖2 氮源種類(A)、比例(B)和添加量(C)對(duì)發(fā)酵液活菌量的影響

由圖2中C可知，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源濃度的逐漸增加，通過消化分解利用氮源生長(zhǎng)繁殖的菌株產(chǎn)酶活力也逐漸增加。當(dāng)有機(jī)氮源添加量為20 g/L時(shí)，發(fā)酵液中活的枯草芽孢桿菌酶活力最高。超過20 g/L時(shí)，酶活逐漸減少，含氮物質(zhì)濃度過高，開始抑制發(fā)酵液中微生物的生命活動(dòng)進(jìn)而導(dǎo)致酶活力快速降低。因此，氮源最佳的添加量為20 g/L。

2.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)鹽優(yōu)化

無機(jī)鹽一般作為菌體細(xì)胞重要組成成分和生理活性的參與者，在一定程度上對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝有促進(jìn)作用[19]。由圖3可知，單獨(dú)一種無機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)淀粉酶的顯著性影響中，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳顯著性較大，所以選擇上述無機(jī)鹽類進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)成分Plackett-Burman篩選試驗(yàn)。

圖3 無機(jī)鹽種類對(duì)發(fā)酵液活菌量的影響Fig.3 Effects of inorganic salts' types on living bacteria amount of fermentation broth

續(xù) 表

2.4 培養(yǎng)基成分Plackett-Burman試驗(yàn)

通過對(duì)上述培養(yǎng)基成分單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，確定了Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)所需的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過分析軟件統(tǒng)計(jì)篩選到對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中活菌數(shù)有顯著性影響的因素，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分組成。按照Minitab 19.0軟件設(shè)計(jì)，因子數(shù)9，次數(shù)20，試驗(yàn)設(shè)計(jì)表與結(jié)果見表1。

表1 營(yíng)養(yǎng)成分Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)表與結(jié)果

由表2可知，回歸分析模型的P值<0.05，表明該模型數(shù)據(jù)效果顯著。糖蜜、酵母粉、硫酸錳、磷酸二氫鉀的P值在置信區(qū)間95%內(nèi)小于0.05，該數(shù)據(jù)模型分析得出糖蜜、酵母粉、硫酸錳、磷酸二氫鉀這4種發(fā)酵培養(yǎng)基成分是影響枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中淀粉酶的顯著性因素，都為正效應(yīng)。由回歸模型方差分析可知，誤差占總誤差的百分比為98.01%，表明該試驗(yàn)中98.01%的數(shù)據(jù)可以用上述模型解釋。

表2 營(yíng)養(yǎng)成分Plackett-Burman設(shè)計(jì)回歸模型方差分析

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)最低添加量試驗(yàn)結(jié)果

通過Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出影響枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活的不顯著因素，即胰蛋白胨、氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀，做營(yíng)養(yǎng)成分最低添加量試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 營(yíng)養(yǎng)成分不顯著因素的最低添加量試驗(yàn)

由表3可知，根據(jù)降低枯草芽孢桿菌實(shí)際生產(chǎn)成本和簡(jiǎn)化培養(yǎng)基配制生產(chǎn)工藝的原則，選擇組成成分各影響因素下發(fā)酵液酶活量達(dá)到最大值所對(duì)應(yīng)的添加量為最低添加量，即胰蛋白胨8.0 g/L、氯化鈣 3 g/L、磷酸氫二鈉0 g/L、磷酸二氫鈉5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L。

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)添加量最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

通過Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出影響枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活的顯著因素，即糖蜜、酵母粉、硫酸錳、磷酸二氫鉀。4個(gè)因素都為正效應(yīng)，按照試驗(yàn)結(jié)果正負(fù)效應(yīng)設(shè)定最陡爬坡試驗(yàn)，其他營(yíng)養(yǎng)成分為上述最低添加量結(jié)果，即胰蛋白胨8.0 g/L、氯化鈉 3 g/L、磷酸氫二鈉0 g/L、磷酸二氫鈉5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L。

由表4可知，當(dāng)糖蜜、酵母粉、硫酸錳和磷酸二氫鉀添加量分別為20，7，6，6 g/L時(shí)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中淀粉酶活力最高，將其作為發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)添加量Box-Benhnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)，進(jìn)一步優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)組合添加量。

表4 營(yíng)養(yǎng)成分最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)添加量響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過最陡爬坡試驗(yàn)得到糖蜜20 g/L、酵母粉7 g/L、硫酸錳6 g/L和磷酸二氫鉀 6 g/L為適宜最佳點(diǎn)，以枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中淀粉酶活為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表5。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

其他發(fā)酵培養(yǎng)基成分配方為：胰蛋白胨8.0 g/L、氯化鈉 3 g/L、磷酸二氫鈉5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L。以淀粉酶活為響應(yīng)值，利用Minitab軟件構(gòu)建了響應(yīng)面二次模型方程，以未編碼單位表示的回歸方程為Y=1976.92+47.58X1+16.48X2-6.65X3+24.75X4-2.72X12-37.94X22-20.19X32+0.16X42+1.88X1X2+4.31X1X3+3.19X1X4+1.00X2X3+3.94X2X4+2.00X3X4。

由表6可知，其中X1、X2和X4對(duì)響應(yīng)值有顯著性影響。失擬項(xiàng)檢驗(yàn)P值為0.757>0.05，說明該模型與枯草芽孢桿菌實(shí)際培養(yǎng)發(fā)酵情況擬合度良好，可以預(yù)測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分的最佳條件。由響應(yīng)面分析預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中淀粉酶極大值所對(duì)應(yīng)的因素編碼值分別為0.997，0.2929，-0.0101，0.993，換算成實(shí)際值，分別是糖蜜24.985 g/L、酵母粉7.5858 g/L、硫酸錳5.9899 g/L、磷酸二氫鉀6.993 g/L。在此預(yù)測(cè)的最佳枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基下淀粉酶活可以達(dá)到2053.15 U/g。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)工作情況，調(diào)整枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基配方為糖蜜25.0 g/L、酵母粉7.6 g/L、硫酸錳6.0 g/L、磷酸二氫鉀7.0 g/L，3次重復(fù)試驗(yàn)平均發(fā)酵液中淀粉酶酶活為(2084±21)U/g。實(shí)際測(cè)量值與二次回歸方程預(yù)測(cè)值2053.15 U/g相吻合。

表6 回歸方程模型系數(shù)評(píng)估及其顯著性檢驗(yàn)

3 結(jié)論

結(jié)合Plackett-Burman篩選試驗(yàn)、營(yíng)養(yǎng)組分最低添加量、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)方法建立了枯草芽孢桿菌發(fā)酵液淀粉酶活響應(yīng)模型。經(jīng)二次回歸方程的方差分析表明，模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性意義，與實(shí)際試驗(yàn)值的擬合程度較好，適用于枯草芽孢桿菌淀粉酶活產(chǎn)量理論預(yù)測(cè)。用上述方程模型得到理論預(yù)測(cè)值為淀粉酶活2053.15 U/g，但優(yōu)化因素值不適合實(shí)際試驗(yàn)使用。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，調(diào)整枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成為糖蜜25.0 g/L、酵母粉7.6 g/L、硫酸錳6.0 g/L、磷酸二氫鉀7.0 g/L、胰蛋白胨8.0 g/L、氯化鈉 3 g/L、磷酸二氫鈉5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L，經(jīng)3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，平均發(fā)酵液淀粉酶酶活為(2084±21)U/g。調(diào)整后實(shí)測(cè)值與二次回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好。