高星 葉甲舟 樸雪岷 李永強 林燕 梁嶸

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1化療一科，2肝膽胰外科

肝細胞癌是全球第六大常見癌癥，也是導致癌癥患者死亡的第三大主要原因[1]。早期肝細胞癌經(jīng)過規(guī)范治療后，5年生存率可達60%～80%。然而肝細胞癌起病隱匿，約2/3的患者初診時已達臨床晚期，無法手術，生存期往往不足1年[2]。目前肝細胞癌篩查主要還是依賴血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）檢測，但臨床上有近1/3的患者AFP陰性；而且急性病毒肝炎活動期及胃癌等疾病也常出現(xiàn)AFP升高。因此，尋找新的早期肝細胞癌標志物尤為重要。

軸突導向因子G1（netrin-G1，NTNG1）位于1號染色體1p13.3區(qū)，編碼539個氨基酸，由10個外顯子組成，大小約為60.5 kDa，屬于神經(jīng)突起生長導向因子Netrins家族的一員[3]。NTNG1最早于2000年在小鼠的中腦和后腦中被發(fā)現(xiàn)，屬于Netrin家族中的膜結(jié)合蛋白型，在其C末端具有糖基磷脂?；煎^（glycosylphosphatidylinositol，GPI），通過結(jié)合GPI實現(xiàn)與細胞膜結(jié)合[4]。生理狀態(tài)下，NTNG1主要在腦組織表達，在軸突導向具有重要作用，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也起重要的調(diào)控作用。目前NTNG1已被發(fā)現(xiàn)在胰腺、肺和乳腺等多臟器中表達，并調(diào)節(jié)多種生理過程，如細胞介導、黏附、遷移和血管生成等[5-6]。HAO等[7]基于數(shù)據(jù)挖掘和深層生物學信息分析發(fā)現(xiàn)，NTNG1在肺腺癌低表達，而在肺鱗狀細胞癌中高表達，但均與較差的生存率呈正相關。FRANCESCONE等[8]也報道NTNG1在胰腺癌組織中高表達，而與生存時間呈負相關；在裸鼠體內(nèi)敲低NTNG1表達后成瘤能力削弱。然而，NTNG1與肝細胞癌的關系鮮見報道。本研究通過檢測NTNG1在肝細胞癌患者血清及其組織中的表達，并分析其臨床意義，以期尋找新的肝細胞癌標志物和治療靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2019年7月至2019年10月本院收治的26例肝細胞癌患者，以及同期于本院門診就診的4例肝炎患者、19名健康受試者、41例其他腫瘤患者（結(jié)直腸癌14例，卵巢癌10例，胰腺癌10例，膀胱癌7例）血清，平均年齡（52.02±13.30）歲，男性63例，女性27例。納入標準：⑴肝癌患者均經(jīng)術后病理診斷均為肝細胞癌，術前未經(jīng)化療、放療及靶向治療；⑵肝炎患者符合乙型病毒性肝炎診斷標準；⑶健康受試者肝功能生化指標正常；⑷其他惡性腫瘤患者均經(jīng)術后病理學檢查明確診斷。排除標準：血清標本溶血、脂血。所有研究對象均簽署知情同意書。

收集2018年7月至2019年12月本院手術切除的63例肝細胞癌組織及其相應鄰近癌旁組織（距離癌組織2 cm以上）。納入標準：⑴初治且接受肝切除術治療；⑵經(jīng)術后病理診斷為肝細胞癌，無其他惡性腫瘤疾病史；⑶術前均未接受化療、放療或靶向治療。排除標準：⑴因肝細胞癌破裂出血行急診手術者；⑵病歷資料不完整或圍手術期死亡者；⑶隨訪時間＜3個月者；⑷合并嚴重心、肺、肝、腎、腦等疾病者。本研究方案經(jīng)廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理與研究委員會批準，獲得患者書面知情同意。

1.2 資料收集與隨訪

查閱病歷收集患者性別、年齡、飲酒史、吸煙史以及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染情況、BCLC分期、TNM分期、HBsAg、AFP、病理性微衛(wèi)星灶、微血管侵犯、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、是否合并肝硬化、有無癌栓等臨床資料。出院后2年內(nèi)每3個月電話隨訪1次，之后每6個月隨訪1次，隨訪截至2021年7月2日。研究終點為總生存期（overall survival，OS），OS定義為手術日至患者死亡或末次隨訪的時間。失訪或末次隨訪仍未死亡的病例作為截尾事件。

1.3 ELISA法檢測血清中NTNG1的表達

抽取患者清晨空腹靜脈血10 mL，室溫凝集30 min，4 000× g離心20 min后，所得血清置于-80℃冰箱保存、備用。將試劑DLCN20（美國R&D公司）復溫，每孔中加入100 μL稀釋液后，分別放入等量的標準品和實驗血清樣品，4℃孵育2 h，加入200 μL偶聯(lián)試劑，4℃孵育2 h，用洗滌液清洗后加入200 μL底物溶液，室溫孵育30 min后加入終止液，檢測波長450 nm處的吸光度（OD）值。通過標準樣品計算血清中NTNG1的濃度。

1.4 Western blot實驗檢測組織中NTNG1的表達

分別取100 mg新鮮肝細胞癌及癌旁組織，加入RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）提取組織蛋白，嚴格按照BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）說明書操作檢測蛋白濃度。每孔加入30～50 μg標準化蛋白樣品，在加滿Tris-Glycine電泳液的垂直電泳槽內(nèi)，濃縮膠在80 V恒壓下電泳至分離膠界面時，調(diào)至120 V繼續(xù)電泳至溴酚藍分離膠底部。轉(zhuǎn)移至聚PVDF膜，加入一抗NTNG1（ab153834，1∶1 500）4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入二抗（ab205719，1∶10 000）室溫孵育1 h；取出PVDF膜，洗膜后滴加ECL工作液反應 2～5 min；于暗室內(nèi)壓片、顯像。以Image J軟件檢測條帶灰度值，以目標條帶灰度值與β-actin（ab179467，1∶5 000）條帶灰度值的比值代表各組織中NTNG1蛋白表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 8.0對實驗數(shù)據(jù)進行圖形處理。計量資料若符合正態(tài)分布，則采用獨立樣本t檢檢，以均數(shù)±標準差表示；若不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示。采用配對設計的Wilcoxon符號秩檢驗比較肝細胞癌組織及其癌旁正常組織中NTNG1蛋白表達水平的差異，并采用χ2檢驗NTNG1蛋白與臨床病理參數(shù)間的關系。用Kaplan-Meier法計算總生存率并繪制生存曲線，組間差異比較采用Log-rank檢驗。采用單因素Cox回歸分析影響患者OS的相關因素，將差異有統(tǒng)計學意義的因素納入多因素Cox回歸模型。血清中NTNG1表達水平不符合正態(tài)分布，首先采用Kruskal-Wallis H檢驗，組間差異有統(tǒng)計學意義，繼而進行Bonferroni檢驗。診斷試驗的評價采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并根據(jù)約登指數(shù)的最大值確定最佳臨界值。以雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NTNG1在肝細胞癌組織及癌旁組織中的表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，NTNG1蛋白在肝細胞癌組織和癌旁組織中均有不同程度表達，見圖1A。NTNG1蛋白在肝細胞癌組織的平均表達量為1.0164，在癌旁組織中為0.6088，肝細胞癌組織中NTNG1蛋白表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-3.374，P=0.001），見圖1B。結(jié)果說明NTNG1蛋白在肝細胞癌組織中呈現(xiàn)高表達。

圖1 63例肝細胞癌患者癌組織及其癌旁組織中NTNG1蛋白的表達Fig.1 Expression of NTNG1 protein in carcinoma and adjacent tissues of 63 patients with hepatocellular carcinoma

2.2 NTNG1蛋白表達水平與肝細胞癌患者臨床病理特征的關系

肝細胞癌組織中NTNG1表達與患者年齡、門脈高壓、腹水、AFP、白細胞水平、總膽紅素水平、包膜侵犯及微血管密度相關（均P＜0.05）；與性別、BCLC分期、分化程度等無關（均P＞0.05）。見表1。

表1 NTNG1表達與63例肝細胞癌患者臨床病理特征的相關性Tab.1 Correlation between NTNG1 protein expression and the clinicopathological characteristics in 63 hepatocellular carcinoma patients

2.3 NTNG1表達水平與肝細胞癌患者OS的關系

63例患者隨訪截至2021年7月，中位隨訪22個月（范圍：2～27個月），其中死亡17例。Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗結(jié)果顯示，NTNG1低表達組的總生存率高于NTNG1高表達組（χ2=6.715，P=0.010）。見圖2。

圖2 NTNG1高表達與低表達肝細胞癌患者的生存曲線Fig.2 Survival curves of hepatocellular carcinoma patients with high and low expression of NTNG1

2.4 影響肝細胞癌患者預后的單因素和多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，性別、BCLC分期、TNM分期、腫瘤大小、NTNG1表達水平與預后相關（均P＜0.05）。

多因素分析結(jié)果顯示，NTNG1高表達是肝細胞癌患者術后預后不良的獨立危險因素（HR=3.715，95%CI=1.207～11.439，P=0.022），男性是肝細胞癌患者術后預后不良的獨立保護因素（HR=0.180，95%CI=0.057～0.563，P=0.003）。見表2。

表2 Cox回歸分析影響肝細胞癌患者術后總生存期的因素Tab.2 Cox analysis of factors affecting postoperative overall survival in hepatocellular carcinoma patients

2.5 肝細胞癌患者及各對照組患者血清中NTNG1表達水平

ELISA法檢測結(jié)果顯示，肝細胞癌患者血清中NTNG1的表達水平高于健康受試者（P＜0.0001），也明顯高于其他腫瘤患者（P＜0.0001），見圖3。

圖3 NTNG1在肝細胞癌患者及各對照組患者血清中的表達情況Fig.3 Expression levels of NTNG1 in serum of patients with hepatocellular carcinoma and each control group

2.6 血清NTNG1在肝細胞癌中的診斷價值

采用ROC曲線評估肝細胞癌患者以及對照組（包括肝炎患者、健康受試者、其他腫瘤患者）共90例受試者血清NTNG1的診斷價值，繪制肝細胞癌區(qū)別于非肝細胞癌患者的ROC曲線，當NTNG1以69.50 pg/mL為臨界值時，診斷肝細胞癌的靈敏度和特異度達到最佳，分別為84.62%和76.56%，ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為 0.8251（95%CI：0.7298～0.9205，P＜0.0001），見圖4。

圖4 肝細胞癌患者血清NTNG1的ROC曲線Fig.4 The ROC curve of NTNG1 in serum of patients with hepatocellular carcinoma

3 討論

肝細胞癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素的過程，包含一系列抑癌基因失活和癌基因異常激活[9]。肝細胞癌發(fā)展過程中，多種與細胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移密切相關的分子信號發(fā)生異常表達或激活，這決定了肝細胞癌高復發(fā)、高轉(zhuǎn)移的生物學特點，進一步導致患者預后不良。因此，深入探索肝細胞癌發(fā)生發(fā)展相關基因，對開發(fā)肝細胞癌新的診斷、藥物標靶和預后標志物具有重要意義。

Netrins作為一類自分泌蛋白或膜結(jié)合蛋白，可以通過結(jié)合不同類型受體發(fā)揮不同作用。最初Netrins在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展中起重要作用，包括調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的遷移、分化和凋亡，并穩(wěn)定血腦屏障，限制免疫細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[10]。此外，Netrins也參與一些非神經(jīng)組織的黏附、遷移和分化等生理過程，如血管生成、淋巴管形成和炎癥等[11]?，F(xiàn)有研究也顯示，Netrins參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，在不同類型腫瘤中發(fā)揮抑制或促進作用[12]。如有研究報道NTN1在膀胱癌[13]、胃癌[14]、非小細胞肺癌[15]等多種惡性腫瘤中表達異常升高。然而，在早期胰腺癌組織中NTN1呈低表達，并通過下調(diào)MEK/ERK通路和抑制整合素β4（ITGB4）表達而抑制早期胰腺癌細胞生長[16]。NTNG1作為Netrins家族的新興角色，同樣發(fā)揮類似功能[7]。有研究報道在結(jié)腸癌中，NTNG1高表達患者發(fā)生DNA甲基化的頻率增加，且與患者預后不良相關[17]。而在無蒂鋸齒狀腺瘤/息肉（SSA/P）和鋸齒狀腺瘤標本中，ANDREW等[18]研究發(fā)現(xiàn)NTNG1的甲基化區(qū)域存在差異性，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應檢測其甲基化狀態(tài)，有助于描述SSA/P的生物學特性，成為患者鑒定和監(jiān)測指標。本研究檢測NTNG1蛋白在肝細胞癌中的表達，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，NTNG1在肝細胞癌組織中顯著高表達，且與患者年齡、門脈高壓、腹水、AFP、白細胞水平、總膽紅素水平、腫瘤包膜及微血管密度等不良特征相關，生存分析也顯示NTNG1高表達患者預后不良，進一步行Cox回歸分析證實NTNG1高表達是預后不良的獨立危險因素，說明NTNG1可能參與肝細胞癌發(fā)生并在其中發(fā)揮促癌作用。

相對于肝組織標本，血清檢測具有創(chuàng)傷性小、操作簡便等優(yōu)點，也更利于臨床推廣。為此，本研究采集了門診就診的肝細胞癌患者以及對照患者包括肝炎患者、健康受試者、其他腫瘤患者等共90例受試者血清，結(jié)果所有受試者均能檢測到NTNG1表達，且肝細胞癌患者血清中NTNG1的表達水平明顯高于健康受試者及其他腫瘤患者，與其在肝細胞癌組織中的表達類似；此外ROC曲線分析顯示，NTNG1診斷肝細胞癌的AUC為0.8251，靈敏度和特異度分別為84.62%和76.56%，說明NTNG1在肝細胞癌中的表達具有一定特異性，且診斷效能良好，可能是潛在的肝細胞癌早期診斷標志物。

綜上所述，NTNG1在肝細胞癌患者組織及血清中呈高表達，且NTNG1高表達是預后不良的獨立危險因素，血清NTNG1對肝細胞癌患者也具有良好的診斷效能，因此NTNG1可能是肝細胞癌患者潛在的早期診斷及預后評估指標。但本研究為單中心小樣本分析，NTNG1在肝細胞癌中的作用仍需進一步研究驗證。