孟繁杰 閻英 熊嬋 王麗麗 趙松 邢思寧 于卉影

作者單位：110016 沈陽(yáng) 1北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院放療科；3中國(guó)醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地

乳腺癌是全球常見的惡性腫瘤，也是絕經(jīng)后婦女的主要死亡原因之一[1]。放射治療是乳腺癌的重要治療手段，而放射抵抗是乳腺癌放射治療的主要障礙[2]。近年來，乳腺癌治療研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但仍有部分浸潤(rùn)性癌易轉(zhuǎn)移且具有放射抵抗性，而治療引起的細(xì)胞衰老現(xiàn)象可能是放射抵抗的原因之一。放射治療誘導(dǎo)癌細(xì)胞的衰老現(xiàn)象會(huì)對(duì)預(yù)后產(chǎn)生不良影響，而放射治療誘導(dǎo)的多倍體現(xiàn)象可能與癌細(xì)胞衰老的可逆性有關(guān)[3]。細(xì)胞自噬和細(xì)胞衰老被認(rèn)為是腫瘤休眠機(jī)制，可使癌細(xì)胞躲避死亡，而多倍體巨細(xì)胞也可能通過細(xì)胞自噬和細(xì)胞衰老發(fā)生去倍化增殖。自噬是一個(gè)溶酶體降解的過程，涉及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞器的自我降解循環(huán)，這對(duì)細(xì)胞平衡具有重要作用。自噬功能障礙與多種人類疾病有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病、炎癥性疾病和癌癥[4-5]。本研究旨在分析放射治療誘發(fā)的多倍體乳腺癌細(xì)胞的衰老和自噬現(xiàn)象，以探討多倍體腫瘤細(xì)胞在放療抵抗及腫瘤復(fù)發(fā)中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；新生牛血清購(gòu)自天津康源生物技術(shù)有限公司；兔抗人PARP抗體、兔抗人PLK1抗體、兔抗人Rb抗體、兔抗人LC3A/LC3B抗體、兔抗人Lamin B1抗體、抗兔IgG（H+L）、β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒、F（ab′）2Fragment（Alexa Fluor 488 Conjugate）抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，兔抗人E2F-1、兔抗人E2F-2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司，Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó)Pierce Biotechnology公司，兔抗人GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Annexin V/PI試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及照射條件

MDA-MB-231細(xì)胞用含10%的新生牛血清的L-15培養(yǎng)液于37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

MDA-MB-231細(xì)胞以3×104/cm2密度，置于T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，將未經(jīng)過放射處理并正常培養(yǎng)的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組，在6 MV X射線模式下，經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定采用7 Gy劑量照射，并分別于第3天、5天、7天、11天和19天觀察細(xì)胞形態(tài)變化，依次記為對(duì)照組（Control）、Day 3組、Day 5組、Day 7組、Day 11組和Day 19組。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞倍性

收集未經(jīng)過放射處理的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞組和放射處理后的各組細(xì)胞，根據(jù)Annexin V/PI試劑盒中的檢測(cè)方法，每組取5×105個(gè)細(xì)胞，在80%冰甲醇中于-20℃固定24 h，每管加入550 μL PI染液，室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞倍性。

1.4 Western blot法檢測(cè)自噬和衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，離心，裂解后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞的蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃一抗在搖床上孵育過夜，TBST洗膜后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在搖床上室溫孵育2 h，再用TBST洗滌，加入ECL發(fā)光底物試劑，X光片顯影、定影。以GAPDH作為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件檢測(cè)蛋白灰度值進(jìn)行分析。

1.5 β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老現(xiàn)象

使用β-半乳糖苷酶染色試劑對(duì)衰老細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定。β-半乳糖苷酶染色試劑盒以X-Gal為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會(huì)生成深藍(lán)色產(chǎn)物，光學(xué)顯微鏡下易觀察到變成藍(lán)色的表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞。細(xì)胞用β-半乳糖苷酶染色固定液室溫固定10 min，加入用β-半乳糖苷酶染色液A、β-半乳糖苷酶染色液B、β-半乳糖苷酶染色液C和X-gal按照比例混合的染色工作液，37℃孵育4 h，普通光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 GEPIA工具分析PLK1在乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)情況

為了研究PLK1在乳腺癌中的表達(dá)情況及多倍體細(xì)胞損傷應(yīng)答是否與自噬相關(guān)，利用GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）工具，在Expression DIY中選擇Boxplot方法，應(yīng)用TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)乳腺組織和乳腺癌組織中的PLK1表達(dá)進(jìn)行差異分析；并且在Correlation中選擇TCGA Tumor數(shù)據(jù)庫(kù)，觀察乳腺癌組織中PLK1與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間細(xì)胞的倍性比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則采用Dunnett′s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較；放射處理組與未經(jīng)處理組細(xì)胞衰老和自噬相關(guān)蛋白的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。PLK1表達(dá)水平在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的比較采用單因素方差分析。PLK1與自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)水平相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放射誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)和DNA含量變化

MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)7 Gy照射后，與對(duì)照組相比，Day 3組、Day 5組和Day 7組細(xì)胞體積明顯增大，且Day 5組的大細(xì)胞周圍開始出現(xiàn)許多“觸角”樣結(jié)構(gòu)，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Day 3組、Day 5組和Day 7組多倍體細(xì)胞亞群（DNA含量＞4 N）比例均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0001），以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明放射成功誘導(dǎo)生成多倍體MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞。Day 11組和Day 19組細(xì)胞多倍體細(xì)胞比例恢復(fù)至正常水平，與Day 3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0001）。見圖2。

圖1 經(jīng)7 Gy照射后MDA-MB-231細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（×200）Fig.1 Morphological changes of MDA-MB-231 cells after 7 Gy irradiation(×200)

圖2 經(jīng)7 Gy照射后MDA-MB-231細(xì)胞的倍性變化Fig.2 Ploidy changes of MDA-MB-231 cells after 7 Gy irradiation

2.2 β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)放射誘導(dǎo)的多倍體乳腺癌細(xì)胞衰老現(xiàn)象

β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，Day 3組、Day 5組和Day 7組與對(duì)照組相比，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)生成藍(lán)色產(chǎn)物，證明細(xì)胞內(nèi)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性提高，放射治療誘導(dǎo)的多倍體MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生衰老現(xiàn)象，見圖3。

圖3 經(jīng)7 Gy照射后MDA-MB-231細(xì)胞衰老的變化（β-半乳糖苷酶×200）Fig.3 Senescence changes of MDA-MB-231 cells after 7 Gy irradiation(β-galactosidase×200)

2.3 放射誘導(dǎo)的多倍體乳腺癌細(xì)胞中自噬和衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Day 3組、Day 5組和Day 7組中DNA損傷修復(fù)蛋白PARP表達(dá)下調(diào)（P=0.0384，0.0204，0.019），DNA合成相關(guān)蛋白R(shí)b（P=0.048，0.011，0.021）和 E2F-1（P=0.006，0.002，0.004）表達(dá)也下調(diào)；而自噬相關(guān)蛋白LC3B/LC3A比值顯著升高（P=0.012，0.049，0.027）。與對(duì)照組比較，Day 3組和Day 5組核膜完整性相關(guān)蛋白Lamin B1表達(dá)下調(diào)（P=0.025，0.011），DNA合成相關(guān)蛋白E2F-2表達(dá)也下調(diào)（P=0.037，0.002）；而Day 3組、Day 5組、Day 7組和Day 11組DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白PLK1表達(dá)上調(diào)（P=0.017，0.002，0.009，0.013），見圖4。

圖4 經(jīng)7 Gy照射后MDA-MB-231細(xì)胞衰老和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of MDA-MB-231 cell senescence and autophagy-related protein after 7 Gy irradiation

2.4 GEPIA工具驗(yàn)證PLK1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平

與正常乳腺組織（n=291）相比，PLK1在乳腺癌組織（n=1085）中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010），見圖5A；PLK1與自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)水平無顯著相關(guān)性（r=0.065，P＝0.034），見圖5B。

圖5 GEPIA工具驗(yàn)證PLK1在乳腺癌組織中的表達(dá)Fig.5 Expression of PLK1 in breast cancer tissue verified by GEPIA website

3 討論

放療主要是通過破壞癌細(xì)胞DNA，將分裂迅速的癌細(xì)胞殺死。但是放療也會(huì)對(duì)正常組織造成損害，從而導(dǎo)致腎毒性、神經(jīng)毒性、骨髓抑制和周圍神經(jīng)病變等不良反應(yīng)[6]。為了平衡放療所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，放療間隔期往往較長(zhǎng)，這也為癌細(xì)胞在治療間隔重新修復(fù)提供了機(jī)會(huì)[7]。關(guān)于抗癌治療誘導(dǎo)多倍體巨細(xì)胞及其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用已有報(bào)道[8]，但是，多倍體細(xì)胞衰老問題卻鮮有研究[9-11]。與治療誘導(dǎo)的多倍體化類似，許多抗癌治療在體內(nèi)和體外誘發(fā)的細(xì)胞衰老也對(duì)治療效果產(chǎn)生潛在影響[12]。有研究表明控制細(xì)胞大小對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)分布以及多細(xì)胞生物體的器官大小和功能至關(guān)重要，其中最佳細(xì)胞功能需要維持最適合的細(xì)胞核質(zhì)比（nuclear-cytoplasmic ratio，N/C）。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生多倍體化時(shí)，細(xì)胞核變大，為了維持細(xì)胞核質(zhì)比例會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)變大[13]。NEUROHR等[14]推測(cè)為了抵消不利的N/C比例，癌細(xì)胞啟動(dòng)衰老程序，隨后多倍體腫瘤巨細(xì)胞發(fā)生不對(duì)稱分裂而產(chǎn)生正?；蚪咏Ｈ旧w數(shù)量的后代。此外，自噬在抗癌治療中可能發(fā)揮對(duì)癌細(xì)胞的保護(hù)作用，而激活自噬可能有助于癌細(xì)胞的抗輻射作用[15]。有研究報(bào)道高比例的多倍體腫瘤巨細(xì)胞是無復(fù)發(fā)生存率較低的獨(dú)立影響因素[16]，說明多倍體可能與腫瘤再生及癌癥復(fù)發(fā)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)放射處理后的MDA-MB-231細(xì)胞分別在第3天、5天和7天都出現(xiàn)很多體積變大的細(xì)胞，且在Day 5組的大細(xì)胞周圍開始出現(xiàn)許多“觸角”樣結(jié)構(gòu)，這可能在為多倍體不對(duì)稱分裂成二倍體細(xì)胞做準(zhǔn)備。Day 7組的大細(xì)胞周圍也聚集許多小細(xì)胞，但在Day 11組和Day 19組大細(xì)胞逐漸減少，同時(shí)小細(xì)胞增多。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Day 3組、Day 5組和Day 7組出現(xiàn)DNA含量大于四倍體的多倍體細(xì)胞，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)多倍體細(xì)胞比例逐漸下降。上述結(jié)果表明照射后的MDA-MB-231細(xì)胞過渡性產(chǎn)生大量多倍體細(xì)胞后逐漸恢復(fù)到二倍體狀態(tài)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在Day 3組、Day 5組和Day 7組多倍體細(xì)胞的形成中伴隨細(xì)胞內(nèi)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增強(qiáng)，DNA損傷修復(fù)蛋白PARP和DNA合成蛋白相關(guān)Rb、E2F-1、E2F-2及核膜完整性相關(guān)蛋白Lamin B1表達(dá)下調(diào)，而DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白PLK1表達(dá)上調(diào)。提示盡管多倍體細(xì)胞發(fā)生衰老現(xiàn)象，但衰老的多倍體細(xì)胞并不是趨向細(xì)胞死亡，而是對(duì)損傷的DNA進(jìn)行積極修復(fù)并幫助多倍體細(xì)胞擺脫細(xì)胞分裂阻滯而進(jìn)入積極的增殖狀態(tài)[13]。目前越來越多的證據(jù)也支持細(xì)胞可以逃離衰老的論點(diǎn)[17-19]。LEIKAM等[20]報(bào)道在黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生衰老時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有高度侵襲性的干細(xì)胞特性的多倍體腫瘤細(xì)胞。以上研究也支持衰老可能不是癌癥發(fā)展的障礙而是驅(qū)動(dòng)力這一觀點(diǎn)。

馬球狀激酶1（polo-like kinase 1，PLK1）是一種參與DNA復(fù)制、損傷應(yīng)答，并且參與各種應(yīng)激反應(yīng)過程的蛋白激酶[21]。既往研究顯示，PLK1在結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等癌癥中表達(dá)過度，且PLK1高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)[22]。乳腺癌細(xì)胞中，有研究報(bào)道PLK1高表達(dá)可以降低細(xì)胞在體內(nèi)和體外對(duì)放療的敏感性，從而導(dǎo)致放療后的腫瘤復(fù)發(fā)[14]。本研究的生信分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)PLK1在乳腺癌組織中呈表達(dá)增高狀態(tài)，但PLK1與自噬相關(guān)蛋白LC3B表達(dá)水平的相關(guān)性并不明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Day 3組、Day 5組中PLK1和自噬相關(guān)蛋白LC3B/LC3A比值顯著升高，說明自噬被激活。這意味著自噬可能與PLK1協(xié)同作用而降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，進(jìn)而導(dǎo)致放療后腫瘤復(fù)發(fā)。自噬在癌癥中起重要作用，最近也有研究表明自噬參與DNA損傷修復(fù)過程[23]，而自噬的減少會(huì)影響對(duì)DNA的修復(fù)，從而使癌癥對(duì)輻射敏感[14]，但其作用機(jī)制仍不清楚。

綜上所述，放射誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生衰老和自噬現(xiàn)象，可能為多倍體細(xì)胞的形成和去倍化增殖提供有利條件。然而，放射治療乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的多倍體化和去倍增殖機(jī)制尚不明確，綜合本研究結(jié)果，推測(cè)可能是由于照射后的MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生DNA損傷從而形成多倍體巨細(xì)胞，并且通過衰老和自噬現(xiàn)象去修復(fù)受損的多倍體巨細(xì)胞，而多倍體巨細(xì)胞中含有細(xì)胞廢物和受損的DNA碎片，功能性自噬的激活可能為多倍體巨細(xì)胞的去倍化增殖提供了有利條件。后續(xù)將進(jìn)一步研究阻斷自噬能否增強(qiáng)放射對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷作用，以提高乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性及降低腫瘤復(fù)發(fā)。