陳雪欣 王一倩

作者單位：511436 廣州 廣州醫(yī)科大學(xué)-廣州生物院聯(lián)合生科院

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一類起源于髓系造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性血液系統(tǒng)疾病，約占所有成人白血病病例的31%[1-3]。目前AML的臨床治療措施主要為阿糖胞苷聯(lián)合蒽環(huán)類抗生素的“3+7”強(qiáng)化誘導(dǎo)化療以及異基因造血干細(xì)胞移植，但是臨床完全緩解后仍有一半的患者復(fù)發(fā)[4-5]。因此，探索AML發(fā)展分子機(jī)制，尋找更有效的治療方案尤為重要。白細(xì)胞介素-33（interleukin 33，IL-33）是在2005年發(fā)現(xiàn)的一種前炎癥細(xì)胞因子，可通過與受體白細(xì)胞介素1受體樣分子1（interleukin-1 receptor like-1，IL1RL1）結(jié)合，參與多種炎癥與免疫反應(yīng)過程[6]。在BCR-ABL表達(dá)的慢性髓系白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）細(xì)胞中，IL-33/IL1RL1通過激活STAT5信號通路而阻斷甲磺酸伊馬替尼對CD34+祖細(xì)胞的抗增殖作用[7]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)IL-33通過MYD88/IRAK4促進(jìn)骨髓增生性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）的骨髓細(xì)胞增生異常[8]。而在嗜堿性白血病中（acute basophilic leukemia，ABL）中，IL-33參與MYB-GATA1融合基因調(diào)控的CD34+原代細(xì)胞的嗜堿性分化[9]。本團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí)IL1RL1在inv（16）AML細(xì)胞表面高度表達(dá)，且外源性IL-33的加入能促進(jìn)AML細(xì)胞株ME-1的存活，通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）可抑制原代小鼠以及AML患者細(xì)胞凋亡[10-12]。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索IL-33/IL1RL1通路對AML細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

人AML細(xì)胞系HL-60、NB4均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC中心（ATCC）；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國ATCC生物生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心；胎牛血清、Pen Strep均購自美國Gibco公司；細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自成都正能生物；HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗購自南京巴傲德生物科技有限公司；周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinases 1，CDK1）抗體（貨號CY516-50）、GAPDH抗體（貨號12231P）均購自Abways公司；p-p38 MAPK抗體（貨號YP0338）、p38 MAPK抗體（貨號YT3513）均購自美國ImmunoWay公司；蛋白酶抑制劑混合液（貨號P6730）購自索萊寶公司；磷酸酶抑制劑（貨號KGP602）購自凱基公司；IL-33（貨號10368-HNAE）購自北京義翹神州科技股份有限公司；p38 MAPK特異性抑制劑SB203580（貨號HY-10256）購自MCE公司；離心機(jī)購自北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；流式細(xì)胞儀CytoFLEX購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將HL-60、NB4細(xì)胞接種至含20%FBS和2%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的HL-60、NB4細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞均勻接種于24孔板或96孔板中培養(yǎng)，并分為對照組（等體積PBS）、IL-33組、SB+IL-33組，其中IL-33組添加100 ng/mL IL-33處理72 h，SB+IL-33組添加10 μmol/L SB203580預(yù)處理1 h后，再采用100 ng/mL IL-33處理72 h。處理結(jié)束后收集備用。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 各組處理好的細(xì)胞用PBS洗滌后，再用95 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106/mL，加入5 μL Annexin V-FITC染液，混勻，冰上避光孵育30 min，再向每管加入5 μL DAPI和200 μL 1×Binding Buffer，混勻。使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率，并用CytExpert 2.0進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 各組處理好的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，用冷乙醇固定12 h以上，用PBS洗滌，離心，棄去乙醇，加入RNase，37℃水浴30 min，再加入PI溶液冰上避光孵育30 min，置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，用Modfit 5.0軟件分析細(xì)胞周期FACS數(shù)據(jù)。

1.2.4 Western blot檢測蛋白的表達(dá)水平 向各組處理好的細(xì)胞中加入RIPA細(xì)胞裂解液和磷酸酶抑制劑以及蛋白酶抑制劑，15 000 r/min離心30 min，取上清（即蛋白溶液），用BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取適量體積的蛋白加入上樣緩沖液，加熱使蛋白變性后，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，再用5%脫脂奶室溫封閉1 h，加入一抗（CDK1、p-p38 MAPK、p38、GAPDH抗體），4℃孵育過夜；次日用相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌后，滴加顯影液進(jìn)行檢測，使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外源性IL-33抑制HL-60和NB4細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，HL-60和NB4細(xì)胞經(jīng)IL-33作用72 h后，細(xì)胞凋亡水平均降低（P＜0.001；P=0.013）；而SB+IL-33組細(xì)胞經(jīng)SB203580和IL-33聯(lián)合處理后，細(xì)胞凋亡水平均高于IL-33組（P=0.003；P=0.023），見圖1。說明IL-33可能通過激活p38 MAPK抑制AML細(xì)胞凋亡。

圖1 外源性IL-33對HL-60和NB4細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effects of exogenous IL-33 on apoptosis of HL-60 and NB4 cells

2.2 外源性IL-33對HL-60和NB4細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，IL-33作用HL-60和NB4細(xì)胞72 h后，兩株細(xì)胞的S期細(xì)胞比例均顯著升高（均P＜0.001）；與IL-33組相比，經(jīng)SB203580和IL-33聯(lián)合處理72 h后，SB+IL-33組細(xì)胞的S期細(xì)胞比例均顯著降低（P=0.004；P=0.016）,見圖2。說明IL-33能有效促進(jìn)AML細(xì)胞增殖，而抑制p38 MAPK激活可逆轉(zhuǎn)IL-33的促增殖作用。

圖2 外源性IL-33對HL-60和NB4細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effects of exogenous IL-33 on cell cycle of HL-60 and NB4 cells

2.3 外源性IL-33誘導(dǎo)HL-60和NB4細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK1的表達(dá)

Western blot檢測p38 MAPK通路蛋白和周期相關(guān)蛋白CDK1的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，IL-33組p-p38MAPK和CDK1表達(dá)水平顯著增高（HL-60：P=0.022，P=0.002；NB4：P=0.009，P=0.013），而SB+IL-33組p-p38 MAPK和CDK1的表達(dá)水平較IL-33組明顯降低（HL-60：P=0.027，P＜0.001；NB4：P=0.008，P=0.017），見圖3。表明IL-33通過p38 MAPK通路促進(jìn)AML細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)疾病發(fā)展。

圖3 外源性IL-33對HL-60和NB4細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of exogenous IL-33 on expression level of cell cycle-related protein in HL-60 and NB4 cells

3 討論

AML具有高度異質(zhì)性，易復(fù)發(fā)，且治療效果差，預(yù)后不良。目前AML總體生存率達(dá)65%以上，但是不同亞型患者的生存率存在顯著差異性[13-14]。因此，探索新的AML治療靶點(diǎn)對進(jìn)一步改善患者存活率極為重要。IL-33為IL-1超家族的新成員，其受體為IL1RL1，主要參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)[15-16]。IL1RL1已被發(fā)現(xiàn)高度表達(dá)于原代AML患者細(xì)胞以及伴inv（16）AML原代小鼠細(xì)胞，并且能通過激活p38 MAPK有效抑制細(xì)胞凋亡[11-12]。還有研究報(bào)道，p38 MAPK信號通路能調(diào)控多種機(jī)體炎癥反應(yīng)，參與細(xì)胞存活以及信號傳導(dǎo)[17-18]。上述研究表明，IL-33/IL1RL1通路可能是AML新的潛在治療靶點(diǎn)，因此本研究利用兩種不同亞型AML細(xì)胞株HL-60以及NB4進(jìn)一步探究IL-33/IL1RL1通路通過介導(dǎo)p38 MAPK維持細(xì)胞存活的機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，HL-60、NB4細(xì)胞經(jīng)外源性IL-33處理后凋亡率均顯著降低，而經(jīng)p38 MAPK特異性抑制劑SB203580和IL-33聯(lián)合處理后細(xì)胞凋亡率較IL-33組顯著升高，提示IL-33/IL1RL1信號可能通過激活p38 MAPK通路抑制細(xì)胞線粒體凋亡通路，從而降低HL-60和NB4細(xì)胞的凋亡能力。本研究還發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，IL-33組的S期細(xì)胞比例和p-p38 MAPK、CDK1的表達(dá)水平均顯著增加，而SB203580和IL-33聯(lián)合處理后S期細(xì)胞比例和p-p38 MAPK、CDK1的表達(dá)水平均較IL-33組顯著降低，提示IL-33可能通過磷酸化p38 MAPK而促進(jìn)CDK1表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程。實(shí)際上，本研究發(fā)現(xiàn)加入外源性IL-33后，相較于NB4細(xì)胞，HL-60細(xì)胞中CDK1表達(dá)水平增加更明顯，說明HL-60細(xì)胞對IL-33的作用更敏感，提示不同亞型AML細(xì)胞在體外對IL-33的敏感性不同，這為將來探究IL-33/IL1RL1通路對不同亞型AML發(fā)展的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

腫瘤微環(huán)境主要指腫瘤細(xì)胞包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、腫瘤相關(guān)纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞等賴以生存的復(fù)雜環(huán)境，而這些細(xì)胞參與了腫瘤細(xì)胞的生長、存活和耐藥性[19]，也能分泌多種細(xì)胞因子以及趨化因子促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。除此之外，失調(diào)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在很大程度上影響腫瘤微環(huán)境，從而影響腫瘤發(fā)展。在AML中，骨髓（bone marrow，BM）微環(huán)境的穩(wěn)定對促進(jìn)白血病發(fā)展十分重要。已有研究報(bào)告了BM微環(huán)境在AML發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制[20-21]。然而，BM中的細(xì)胞因子與白血病細(xì)胞活性之間的關(guān)系尚不完全清楚。IL-33屬于IL-1細(xì)胞因子家族，參與多種生物學(xué)活動(dòng)，包括炎癥、免疫反應(yīng)和感染過程[6]。有研究報(bào)道，外源性IL-33的加入能有效促進(jìn)CML細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)AML細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生[7]。本研究通過利用不同AML細(xì)胞株，同樣發(fā)現(xiàn)AML細(xì)胞可能借助BM微環(huán)境中的IL-33激活I(lǐng)L1RL1受體，從而調(diào)節(jié)下游蛋白活性，最終抑制AML細(xì)胞凋亡。但是既往研究也顯示，IL-33可能激活除p38以外的信號通路，包括NF-κB以及ERK等[6]。因此，IL-33/IL1RL1軸發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在不同亞型AML細(xì)胞株中，外源性IL-33的加入能有效降低細(xì)胞凋亡率，阻止細(xì)胞周期阻滯，而IL-33可能通過磷酸化p38 MAPK而促進(jìn)CDK1表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程。因此，IL33/IL1RL1信號通路可能是AML治療的新靶點(diǎn)，這為AML治療提供了新的思路。