馬瑞雪 盧鴻健 楊晨 叢薇 王源 章廣玲 張榮花

1華北理工大學臨床醫(yī)學院(河北省醫(yī)工融合精準醫(yī)療重點實驗室) 河北唐山 063000；2華北理工大學基礎(chǔ)醫(yī)學院(河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學重點實驗室)

胰腺癌(Pancreatic cancer，PC)是目前最常見的人類致命性、惡性腫瘤之一，屬于常見的消化道腫瘤[1]。盡管近年來包括化療、放療和分子治療在內(nèi)的治療方法越來越多，但胰腺癌患者的總體5年生存率仍低于7%。大多數(shù)胰腺癌患者確診時已為晚期階段，處于外科手術(shù)切除標準之外[2]，患者治愈的機會較小，預后不良。在過去的幾十年中，已明確了幾個與胰腺癌腫瘤發(fā)生相關(guān)的危險因素，但在胰腺癌進展的分子機制方面進展甚微，缺乏高敏感性、高特異性的生物標記物，亟需開發(fā)新的特異性標記物為臨床診斷和治療提供參考。

miRNAs參與人體細胞生命進程的許多重要環(huán)節(jié)，是真核生物中一種基因長度大約為20bp的非編碼小RNA，與癌癥的發(fā)生和進展均有關(guān)。成熟的miRNAs可通過堿基互補配對靶向相關(guān)mRNA的3'-未翻譯區(qū)域(UTR)抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄從而有效地負性調(diào)控其靶基因表達[3]。miRNAs涉及多個腫瘤進程，例如惡性腫瘤細胞的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移、分化等，在過去十年中，miRNA在致癌過程中的失調(diào)已被廣泛研究，其參與各種類型癌癥的進展，例如急性淋巴細胞白血病[4]、口腔鱗狀細胞癌[5]、胰腺癌[6]。有研究在BRL-3A肝癌細胞中，miR-203a-3p激活PI3K/Akt信號傳導通路，從而提高肝癌細胞的增殖能力[7]。Chen L等研究發(fā)現(xiàn)miR-203a-3p可促進結(jié)直腸癌的增殖、集落形成、遷移和侵襲[8]。但是miR-203a-3p在胰腺癌中的作用及其機制尚未見報道。本文將討論miR-203a-3p對Panc-1生長增殖、克隆形成和遷移侵襲的影響，為胰腺癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 實驗所用的胰腺癌細胞系A(chǔ)spc-1、Panc-1和人胰腺導管上皮細胞(HPNE)購自上海富衡生物技術(shù)公司。

1.1.2主要試劑 CCK-8試劑產(chǎn)品購自北京莊盟生物基因公司；SYBR Premix EX Taq試劑盒購自北京聚合美生物技術(shù)公司；miR-203a-3p inhibitor、miR-203a-3p mimics、NC inhibitor、NC mimics、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于上海吉瑪生物技術(shù)有限公司。

1.2研究方法

1.2.1qRT-PCR檢測miR-203a-3p的表達水平 胰腺癌細胞Aspc-1、Panc-1和HPNE分別培養(yǎng)于含有10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的RPM-1640培養(yǎng)基中。qRT-PCR測定Aspc-1、Panc-1和HPNE中miR-203a-3p的表達水平，將對數(shù)生長期的細胞以5×104/孔的方式接種于6孔板。根據(jù)試劑盒說明，按照標準TRIzol法提取細胞的總RNA。然后以提取出的總RNA作為模板，利用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒(上海吉瑪公司)，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以內(nèi)參基因U6作為陽性對照基因校正PCR模板的拷貝數(shù)，U6上下游引物和miR-203a-3p上下游引物序列分別如下：U6 snRNA-FO：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC -3’，U6 snRNA-RE：5’-TTCACGAATTTGCGTGTCATC -3’；miR-203a-3p-FO：5’-CCGCTCGTGAAA TGTTTAGG -3’，miR-203a-3p-RE：5’-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA -3’。各實驗至少重復3次，實驗組與對照組的基因相對表達量以2-△△Ct計算。

1.2.2CCK-8檢測細胞的增殖能力 將Panc-1細胞接種到96孔培養(yǎng)板，3×103/孔。為闡明miRNA-203a-3p在胰腺癌發(fā)展中的生物學功能，將模擬物miR-203a-3p mimics、抑制劑miR-203a-3p inhibitor及其對照NC mimics、NC inhibitor分別對Panc-1細胞進行轉(zhuǎn)染。實驗分為NC mimics組、miR-203a-3p mimics組、NC inhibitor組、miR-203a-3p inhibitor組，轉(zhuǎn)染后0、24、48、72h時向各孔中緩慢滴加10μL CCK-8試劑以測定細胞增殖，37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2～4h后測量吸光度值(即OD值)，OD值于酶標儀在450nm波長下測量所得。每組實驗至少重復3次，計算各組細胞吸光度值的平均值和標準差，繪制折線圖。

1.2.3集落形成實驗檢測細胞的集落形成能力 胰腺癌Panc-1細胞中轉(zhuǎn)染模擬物miR-203a-3p mimics或抑制劑miR-203a-3p inhibitor及其對照，將過表達或miR-203a-3p表達受到抑制的Panc-1細胞培養(yǎng)48h后接種至6孔板中，1×103個細胞/孔。按時更換新鮮培養(yǎng)液, 2～3次/d,并生長2周；然后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細胞兩次，并用結(jié)晶紫進行染色。在顯微鏡下計數(shù)10個隨機視野中的菌落數(shù)，并計算每個視野平均菌落數(shù)(選取細胞數(shù)≥50個的集落作為計數(shù)對象)，實驗重復3次。計算分析集落數(shù)量平均值和標準差并繪制柱狀圖。

1.2.4Transwell小室檢測遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù) 通過無基質(zhì)凝膠或有基質(zhì)凝膠的Transwell小室檢測細胞的遷移和侵襲。遷移實驗Transwell小室基底膜不鋪Matrigel 基質(zhì)膠，將miR-203a-3p mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染到胰腺癌細胞系Panc-1中48h后，細胞孵育于100μl體積的血清游離培養(yǎng)基中，置于Transwell上室，下室培養(yǎng)基為20%胎牛血清，2×104/孔，進行遷移試驗。Transwell小室基底膜上層加50μL Matrigel 基質(zhì)膠，Panc-1接種數(shù)量為3×104/孔，下室培養(yǎng)基為20%胎牛血清，進行侵襲試驗。細胞培養(yǎng)24h，在侵襲或遷移之后，Transwell小室表面的細胞用棉簽擦拭去除，甲醛固定細胞并用結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察并拍照，Image J軟件計數(shù)遷移侵襲細胞個數(shù)，計算穿膜細胞數(shù)量的平均值和標準差，每組重復進行3次。

2 結(jié)果

2.1檢測miR-203a-3p在Aspc-1、Panc-1和HPNE中的表達水平 利用qRT-PCR方法檢測miR-203a-3p在HPNE、Aspc-1和Panc-1中的表達水平。與HPNE相比，Aspc-1中miR-203a-3p的表達水平上升了7.71倍，Panc-1中miR-203a-3p的表達水平上升了6.15倍(P<0.05)，miR-203a-3p在胰腺癌細胞中的表達水平顯著升高，見圖1。

圖1 miR-203a-3p在HPNE、Aspc-1、Panc-1細胞系中的表達水平

2.2qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染的有效性 在Panc-1中通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics過表達miR-203a-3p或轉(zhuǎn)染miR-203a-3p inhibitor抑制miR-203a-3p的表達，實驗分為miR-203a-3p mimics組、NC mimics組、miR-203a-3p inhibitor組、NC inhibitor組。轉(zhuǎn)染后48h提取各組細胞總RNA，利用qRT-PCR檢測各組細胞中miR-203a-3p的表達水平，分別與其對照組相比。在Panc-1中轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics后miR-203a-3p的表達水平升高了27.94倍，而轉(zhuǎn)染miR-203a-3p inhibitor后miR-203a-3p表達水平降低了0.47倍(P<0.05)，見圖2。結(jié)果提示在Panc-1中，轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics能夠使miR-203a-3p的表達升高，而轉(zhuǎn)染miR-203a-3p inhibitor能夠使miR-203a-3p的表達降低。

圖2 qRT-PCR檢測胰腺癌細胞系Panc-1轉(zhuǎn)染效率

2.3miR-203a-3p對Panc-1增殖和克隆形成能力的影響 本次實驗分為miR-203a-3p mimic組、NC mimic組和miR-203a-3p inhibitor組、NC inhibitor組，利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000分別將miR-203a-3p mimics、NC mimics、NC inhibitor和miR-203a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染到Panc-1細胞中。在轉(zhuǎn)染0、24、48、72h后，采用CCK-8實驗和集落形成實驗檢測miR-203a-3p對Panc-1增殖能力的影響。CCK-8實驗結(jié)果顯示，在48、72h時，miR-203a-3p mimic組Panc-1的增殖能力顯著增強，miR-203a-3p inhibitor組Panc-1的增殖能力顯著減弱(P<0.05)，見圖3A、3B。轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic和miR-203a-3p inhibitor后48h檢測Panc-1的集落形成能力，分別與其對照組相比，miR-203a-3p mimic組中Panc-1的集落數(shù)增加了6個，而miR-203a-3p inhibitor組中Panc-1的集落數(shù)減少了19個(P<0.05)，見圖3C、3D。以上結(jié)果表明，miR-203a-3p mimics有效地促進了Panc-1的增殖和克隆形成能力，而miR-203a-3p inhibitor有效地抑制了Panc-1的增殖和克隆形成。

圖3 miR-203a-3p對Panc-1細胞增殖和克隆形成能力的影響

2.4miR-203a-3p對Panc-1遷移和侵襲能力的影響 實驗分為四組：NC mimics組、miR-203a-3p mimics組、NC inhibitor組、miR-203a-3p inhibitor組，每組細胞分別轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-203a-3p mimics、NC inhibitor、miR-203a-3p inhibitor。Transwell實驗結(jié)果顯示，與NC mimics組比較，miR-203a-3p mimics組中轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics 48h后，miR-203a-3p表達水平增加，遷移細胞數(shù)增加了214個，侵襲細胞數(shù)增加了208個(P<0.05)見圖4；與NC inhibitor組比較，miR-203a-3p inhibitor組中轉(zhuǎn)染miR-203a-3p inhibitor 48h后，miR-203a-3p表達被抑制，遷移細胞數(shù)減少了208個，侵襲細胞數(shù)減少了273個(P<0.05)，見圖5。結(jié)果表明miR-203a-3p過表達可以促進Panc-1遷移和侵襲的能力，而降低miR-203a-3p表達水平可抑制Panc-1遷移和侵襲的能力。

圖4 miR-203a-3p促進細胞系Panc-1的遷移

圖5 miR-203a-3p促進細胞系Panc-1的侵襲

3 討論

胰腺癌發(fā)病隱匿、轉(zhuǎn)移性強、復發(fā)率高，尚無特效治療方法。目前臨床上胰腺癌早期診斷率較低，大多數(shù)患者確診時已處于晚期階段[9]，治療和預后的進展仍然有限。

miRNAs可通過調(diào)控促癌基因或者抑癌基因的表達，從而在腫瘤細胞遷移、侵襲、克隆形成中起著關(guān)鍵作用[10]。miRNAs在腫瘤中高表達可通過負向調(diào)控腫瘤抑制基因的表達來促進惡性腫瘤細胞的生長及增殖，具有促腫瘤的作用；miRNAs在腫瘤中低表達則負向調(diào)控促癌基因的表達而起到抑癌基因的效果，具有抑制腫瘤的作用。無論促癌功能還是抑癌功能的最終實現(xiàn)依賴于miRNAs對靶基因的調(diào)控。有研究利用高通量基因芯片技術(shù)和大數(shù)據(jù)進行分析，揭示了一些在胰腺癌患者中高表達的miRNAs，如：miR-186、miR-203、miR-1266、miR-1293和miR-224[11]，以及低表達的 miRNAs，如：miR-326，miR-424，miR-4722和miR-125b[12]。

近幾十年來，越來越多的研究強調(diào)miRNA失調(diào)在卵巢癌、肺癌、胃癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中的分子機制和意義。亦有新證據(jù)表明，胰腺癌中的miRNA可能是腫瘤發(fā)生的主要因素之一，并可以作為胰腺癌診斷和治療的預測性生物標志物和靶標。Chen等研究miR-203a-3p與肺癌的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織和細胞中其表達水平降低[13]，并且LINC 00342通過靶向miR-203a-3p促進了肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和集落形成。此外，過表達miR-203a-3p可通過抑制糖原合成酶激酶-3β表達促進腎細胞癌細胞增殖而抑制其凋亡[14]。本研究首先采用qRT-PCR檢測Aspc-1、Panc-1和HPNE中miR-203a-3p的表達水平，結(jié)果提示miR-203a-3p的表達水平在Aspc-1、Panc-1中分別升高7.71倍和6.15倍。采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將miR-203a-3p mimics模擬物或miR-203a-3p inhibitor抑制劑及其對照NC mimics或NC inhibitor分別轉(zhuǎn)染到Panc-1中，通過CCK8實驗、集落形成實驗、Transwell實驗分別檢測了miR-203a-3p對于Panc-1的生長增殖和遷移侵襲的影響，結(jié)果顯示miR-203a-3p能夠有效地促進Panc-1的生長增殖、遷移和侵襲。

本文只進行了miR-203a-3p對胰腺癌細胞影響的研究，在后續(xù)研究中，我們會通過生物信息學網(wǎng)站預測miR-203a-3p發(fā)揮作用的候選靶基因，并通過雙熒光素酶實驗確定其對候選靶基因發(fā)揮調(diào)控作用的機制，構(gòu)建靶基因的過表達載體以及抑制靶基因表達的siRNA，研究靶基因?qū)σ认侔┘毎淖饔檬欠衽cmiR-203a-3p相反，以期為胰腺癌的早期診斷提供有效的分子標記物，為胰腺癌的臨床治療提供實驗依據(jù)和創(chuàng)新策略。