李海強 李 彥 沈徐寧 蔣紅鋼

浙江省嘉興市第一醫(yī)院胃腸外科，浙江嘉興 314000

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的癌癥之一，近年來CRC 發(fā)病率和死亡率迅速上升，5 年生存率很低[1-2]。因此，迫切需要有效的CRC 治療策略。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一組內(nèi)源性非編碼轉錄本，長度超過200 個核苷酸[3]，在細胞生長和腫瘤發(fā)生等多種過程中發(fā)揮作用。有文獻證明，lncRNA 參與CRC 進展，如下調(diào)lncRNA CRNDE抑制CRC 細胞增殖[4]，lncRNA ANCR 結合EZH2 調(diào)節(jié)CRC 侵襲和轉移[5]。TUG1 是最近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，可能在不同的腫瘤中發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用[6]，如LncRNA TUG1 靶向微RNA-145（microRNA-145，miR-145）影響甲狀腺乳頭狀癌細胞遷移和EMT 形成[7]；lncRNA-TUG1/EZH2 軸通過miR-382 促進胰腺癌細胞增殖、遷移和EMT 表型形成[8]。然而，TUG1 在結直腸癌變過程中的作用尚未被鑒定。因此，本研究主要探討LncRNA TUG1 對Colo320 細胞發(fā)展的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

收集浙江省嘉興市第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2020 年8 月至2021 年2 月經(jīng)病理診斷證實的、術前未接受放化療的30 例CRC 患者癌組織及癌旁組織（距癌組織5 cm）標本。男18 例，女12 例；年齡34～80 歲，平均（57.00±9.56）歲；分化程度：低分化3 例，中分化19 例，高分化8 例；TNM 分期：Ⅰ期5 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期6 例，Ⅳ期4 例。本研究通過我院倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。

1.2 主要材料

Colo320、HCT116 和NCM460 細胞購于中國科學院上海細胞庫；DMEM 培養(yǎng)基購于美國HyClone 公司（貨號：SH30243.01B）；熒光定量PCR 試劑盒購于大連寶生物有限公司（貨號：RR096A）；Transwell 小室購于Millipore 公司（批號:PIHT30R48）；TUG1 siRNA、KIAA1199 siRNA 等質粒購于北京擎科生物公司；miR-145 抑制劑、miR-145 模擬物購于Genepharma 公司；E-cadherin 抗體購于英國abcam 公司（批號：ab40772、ab163528）。

1.3 Colo320、HCT116 和NCM460 細胞培養(yǎng)

培養(yǎng)皿中加入含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100U/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)Colo320、HCT116和NCM460 細胞，匯合度達95%左右時傳代培養(yǎng)。

1.4 Colo320 細胞轉染及分組

胰酶消化對數(shù)生長期的Colo320 細胞，將細胞懸液鋪于12 孔板，用Turbofect 將質粒轉染Colo320 細胞，孵育48 h 后收集細胞進行后續(xù)實驗。轉染后的細胞分組為：①下調(diào)對照組、TUG1 下調(diào)組、KIAA1199 下調(diào)組；②TUG1 野生型（LncRNA TUG1 wt）+miR-145模擬物組、LncRNA TUG1 wt+模擬物對照、LncRNA TUG1 突變型（LncRNA TUG1 mut）+模擬物對照組和LncRNA TUG1 mut+miR-145 模擬物組；③過表達對照+模擬物對照組、TUG1 過表達+模擬物對照組、過表達對照+miR-145 模擬物組、TUG1 過表達+miR-145 模擬物組；④下調(diào)對照+抑制劑對照組、TUG1 下調(diào)+抑制劑對照組、下調(diào)對照+miR-145 抑制劑組、TUG1下調(diào)+miR-145 抑制劑組。

1.5 CCK-8 法

CCK-8 法檢測轉染后Colo320 細胞活力，將細胞鋪于96 孔板中，每組設置3 個復孔，24、48、72 h 后PBS 清洗3 次，每孔加入10 μl CCK-8，孵育2 h，酶標儀450 nm 處讀取吸光度。

1.6 雙熒光素酶報告基因活性檢測

雙熒光素酶報告基因活性檢測LncRNA TUG1與miR-145 的相關性，構建LncRNATUG1wt 和LncRNA TUG1 mut 載體。取對數(shù)生長期的Colo320 細胞鋪于12 孔板中，細胞密度為75%左右時，LncRNA TUG1 wt、LncRNA TUG1 mut 分別與miR-145 模擬物、模擬物對照在Turbofect 作用下共轉染至Colo320 細胞，孵育48 h 后檢測熒光素酶活性。

1.7 細胞侵襲實驗

200 μl Matrigel 添加至Transwell 上室，靜置使其干燥成膠狀。胰酶消化轉染成功的Colo320 細胞，200 μl 細胞懸液加入上室，下室添加400 μl 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫浸染，高倍視野（200×）下觀察細胞侵襲情況。

1.8 RT-qPCR 檢測LncRNA TUG1、miR-145 和KIAA1199的基因表達

轉染成功的Colo320 細胞培養(yǎng)48 h 后，加入Trizol提取細胞和組織RNA，反轉為cDNA，以cDNA 為模板進行RT-qPCR 檢測。程序為預變性95℃、10 min，變性95℃、10 s，退火60℃、20 s，延伸72℃、30 s，40 個循環(huán)。每組設有3 個重復，GAPDH 為內(nèi)參，2-△△Ct法分析結果。引物見表1。

表1 引物序列

1.9 Western blot 檢測上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關蛋白E-cadherin、Ncadherin、Vimentin、Snail 及KIAA1199 表達

全蛋白提取試劑盒提取組織和細胞蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳后轉移到PVDF 膜，封閉3 h，加入特異性一抗4℃過夜孵育，二抗37℃孵育2 h，TBST 清洗干凈，蛋白曝光后進行灰度分析，重復實驗3 次。

水稻秧苗機械化栽插過程中，結合不同秧苗狀態(tài)，可以將水稻插秧機分為洗苗型、帶土型和兩用型，按照機械的動力來源不同，可以將水稻插秧機分為人力和機動兩種。對于以家庭為單位的農(nóng)戶來說，為了切實保證秧苗狀態(tài)、促進秧苗成活，一般選擇兩用型人力水稻插秧機。而對于大型農(nóng)田或規(guī)?；N植戶，為了節(jié)省人力、減少人工成本投入、提高插秧效率，大多選擇兩用型機動水稻插秧機。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 癌組織和癌旁組織中LncRNA TUG1、miR-145、KIAA1199 表達比較

癌組織中LncRNA TUG1 表達量為（3.56±1.17），高于癌旁組織的（1.37±0.85），差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）。癌組織中miR-145 表達量為（0.49±0.04），低于癌旁組織的（1.26±0.52），差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）。癌組織中KIAA1199 表達量為（3.24±1.08），高于癌旁組織的（1.21±0.76），差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）。

2.2 Colo320、HCT116 和NCM460 細胞中LncRNA TUG1、miR-145、KIAA1199 表達比較

HCT116 細胞LncRNA TUG1 表達量為（2.08±1.02），Colo320 細胞LncRNA TUG1 表達量為（2.67±0.92），NCM460 細胞LncRNA TUG1 表達量為（1.15±0.06）；HCT116、Colo320 細胞中LncRNA TUG1 表達量高于NCM460 細胞中LncRNA TUG1 表達量，差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）。

HCT116 細胞miR-145 表達量為（0.62±0.07），Colo320 細胞miR-145 表達量為（0.43±0.09），NCM460細胞miR-145 表達量為（1.43±0.23）；HCT116、Colo320細胞中miR-145 表達量低于NCM460 細胞中miR-145 表達量，差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）。

HCT116 細胞KIAA1199 表達量為（1.89±0.85），Colo320 細胞KIAA1199 表達量為（2.76±1.03），NCM460細胞KIAA1199 表達量為（1.28±0.21）；HCT116、Colo320細胞中KIAA1199 表達量高于NCM460 細胞中KIAA1199 表達量，差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）。

2.3 LncRNA TUG1 對Colo320 細胞的增殖、侵襲及EMT 的影響

培養(yǎng)24、48、72 h，TUG1 下調(diào)組細胞活力低于下調(diào)對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05），見圖1A。TUG1 下調(diào)組細胞侵襲數(shù)目低于下調(diào)對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05），見圖1B。TUG1 下調(diào)組N-cadherin、Vimentin 和Snail 表達低于下調(diào)對照組，E-cadherin表達高于下調(diào)對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01），見圖1C。

圖1 LncRNA TUG1 對Colo320 細胞的增殖、侵襲及EMT 的影響

2.4 LncRNA TUG1 與miR-145 的關系

圖2 LncRNA TUG1 與miR-145 的結合位點

2.5 LncRNA TUG1 通過miR-145 對Colo320 細胞的侵襲、增殖及EMT 的影響

TUG1 過表達+模擬物對照組細胞侵襲數(shù)目高于過表達對照+模擬物對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）；過表達對照+miR-145 模擬物組細胞侵襲數(shù)目低于過表達對照+模擬物對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；TUG1 過表達+miR-145 模擬物組細胞侵襲數(shù)目高于過表達對照+miR-145 模擬物組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）。見圖3A。

培養(yǎng)24、48、72 h，TUG1 過表達+模擬物對照組細胞活力高于過表達對照+模擬物對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）；過表達對照+miR-145 模擬物組細胞活力低于過表達對照+模擬物對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）；TUG1 過表達+miR-145 模擬物組細胞活力高于過表達對照+miR-145 模擬物組，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）。見圖3B。

TUG1 過表達+模擬物對照組N-cadherin、Vimentin、Snail 表達高于過表達對照+模擬物對照組，E-cadherin 表達低于過表達對照+模擬物對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。過表達對照+miR-145模擬物組N-cadherin、Vimentin、Snail 表達低于過表達對照+模擬物對照組，E-cadherin 表達高于過表達對照+模擬物對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）。TUG1 過表達+miR-145 模擬物組N-cadherin、Vimentin、Snail 表達高于過表達對照+miR-145 模擬物組，E-cadherin 表達低于過表達對照+miR-145 模擬物組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖3C。

圖3 Lnc RNA TUG1 通過miR-145 對Colo320 細胞的增殖、侵襲及EMT 的影響

2.6 LncRNA TUG1 通 過miR-145 對KIAA1199 表達的影響

TUG1 下調(diào)+抑制劑對照組KIAA1199 表達低于下調(diào)對照+抑制劑對照組，下調(diào)對照+miR-145 抑制劑組KIAA1199 表達高于下調(diào)對照+抑制劑對照組，TUG1 下調(diào)+miR-145 抑制劑組KIAA1199 表達低于下調(diào)對照+miR-145 抑制劑組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）。見圖4。

圖4 LncRNA TUG1 通過miR-145 對KIAA1199 表達的影響

2.7 KIAA1199 對Colo320 細胞的增殖、侵襲及EMT 的影響

培養(yǎng)24、48、72 h，KIAA1199 下調(diào)組細胞活力低于下調(diào)對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05），見圖5A。KIAA1199 下調(diào)組侵襲數(shù)目低于下調(diào)對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01），見圖5B。KIAA1199下調(diào)組N-cadherin、Vimentin、Snail 表達低于下調(diào)對照組，E-cadherin 表達高于下調(diào)對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01），見圖5C。

圖5 KIAA1199 對Colo320 細胞的增殖、侵襲及EMT 的影響

3 討論

研究顯示[9-12]，lncRNA 在調(diào)節(jié)腫瘤過程中發(fā)揮關鍵作用，lncRNA TUG1 高表達促進卵巢癌細胞增殖、遷移[13]；LncRNA TUG1 通過調(diào)控miR-132-3p/SIRT1減輕脂多糖誘導的小腸上皮細胞損傷[14]。Li 等[15]研究顯示，LncRNA TUG1 在人腦膠質瘤中發(fā)揮腫瘤抑制作用。在不同的腫瘤中，LncRNA TUG1 發(fā)揮了不同的生物學功能。本研究結果顯示，TUG1 在癌組織、Colo320、HCT116 細胞中高表達。TUG1 在Colo320 細胞轉移過程中是發(fā)揮癌基因的功能，本研究通過siRNA技術為實驗結果提供了依據(jù)，表明LncRNA TUG1 對于CRC 發(fā)展至關重要。

研究顯示[16-18]，LncRNA 能夠靶向結合miRNA 參與腫瘤的發(fā)展。本研究使用miRcode 數(shù)據(jù)庫預測TUG1 與miR-145 之間存在結合位點，結果顯示LncRNA TUG1 wt+miR-145 模擬物組熒光素酶活性低于LncRNA TUG1 wt+模擬物對照（P <0.01）。TUG1 基因過表達促進了Colo320 細胞的發(fā)展，而過表達miR-145 逆轉了促進作用，提示lncRNA TUG1 可負調(diào)控miR-145 促進Colo320 細胞的侵襲和EMT。研究顯示，miR-590-5p、miR-3150b-3p 等miRNAs 在CRC 增殖和轉移中發(fā)揮作用[19-22]。miR-145 是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，肝癌患者血清miR-145 表達水平升高，可作為肝癌預后的評估指標[23]；miR-145 過表達增強宮頸癌細胞的輻射敏感性[24]。然而，miR-145 在CRC 細胞系或組織中的表達及其作用尚未被討論。本研究重點探討了miR-145 在Colo320 細胞發(fā)展中的作用，結果顯示miR-145 在癌組織、Colo320、HCT116 細胞中表達下調(diào)，過表達miR-145 抑制了Colo320 細胞發(fā)展，與之前報道一致[25]。這為miR-145 在CRC 進展中的作用提供了新的證據(jù)。

KIAA1199 被定義為細胞遷移誘導蛋白，KIAA1199在許多癌癥中過表達，并通過不同的信號通路促進癌癥轉移。Evensen 等[26]發(fā)現(xiàn)KIAA1199 在乳腺癌轉移組織中上調(diào)，導致乳腺癌細胞發(fā)生EMT。然而，在Colo320 細胞中，lncRNA TUG1 可通過miR-145 上調(diào)KIAA1199 表達，且KIAA1199 siRNA 轉染細胞后明顯抑制癌細胞轉移，提示KIAA1199 參與了CRC 的進展。

綜上所述，LncRNA TUG1 通過miR-145 促進KIAA1199 表達，加速Colo320 細胞增殖、侵襲及EMT。TUG1 可能是治療CRC 的一個潛在靶點。