周奇妙 彭阿建 張 熙 朱芙蓉 譚梅鑫 王曉琴 彭佳蕊 熊 武

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科，湖南長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410007

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種可以多向分化的成體干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的修復(fù)重建能力，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，甚至在特定環(huán)境下可分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)損傷部位的血管再生和內(nèi)皮重建[1]。目前關(guān)于MSCs 參與血管新生的研究已成為血管新生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而這與其細(xì)胞活性和增殖能力關(guān)系緊密。現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)，中藥干預(yù)可提高M(jìn)SCs 的活性和增殖能力，有助于MSCs 發(fā)揮促進(jìn)血管新生的作用[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參含人參皂苷（ginsenoside，GS）Ro、Rb1、Re、Rg1 等多種皂苷類成分，以及多糖、氨基酸、黃酮類等，其中GS-Rg1 為其主要活性成分之一[4]。GS-Rg1 具有降血糖[5]、降血脂[6]、促血管新生[7]、抗氧化應(yīng)激[8]、減輕炎癥反應(yīng)[9]等作用。目前關(guān)于GS-Rg1 發(fā)揮血管新生作用的研究主要集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞，而針對GS-Rg1 是否能通過誘導(dǎo)非內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管新生的研究鮮有報(bào)道。本研究將GS-Rg1 聯(lián)合具有血管內(nèi)皮分化潛能的人臍血MSCs 進(jìn)行細(xì)胞活性和體外成血管分化研究。

1 材料與方法

1.1 主要藥品試劑

胎牛血清（10270-106），購自美國GIBCO；抗血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（anti-platelet endothelial cell adhesion molecule-1，anti-CD31）抗體（ab28364），抗血管性血友病因子（anti-von Willebrand factor，antivWF）抗體（ab154193），山羊抗小鼠IgG H&L（異硫氰酸熒光素）（ab6785），購自英國Abcam；CCK-8 試劑盒（C0037），購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；DMEM/F12 培養(yǎng)基（SH30023.01B）、磷酸鹽緩沖液（SH30256.01B），購自美國Hyclone；Matrigel 基質(zhì)膠（354234），購自美國BD BioCoat；成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（HUXMA-90021），成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（RASMD-90031），購自美國Cyagen；成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒（HUXUB-90042），購自美國OriCell；DAPI 染液（D9542）、油紅O 溶液（O1391-250ML）、茜素紅染液（130-22-3RT），購自美國Sigma；阿利新藍(lán)染液（MAS0981），購自中國MesGen；抗人CD44 抗體（異硫氰酸熒光素）（338803）、抗人CD73 抗體（藻紅蛋白）（344003）、抗人CD105 抗體（別藻藍(lán)蛋白）（323207），購自美國Biolegend。

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（XD-101），日本SANYO；生物倒置顯微鏡（BX51），日本OLYMPUS；臺式低速離心機(jī)（5804R），德國Eppendorf；熱電酶標(biāo)儀（MK3），美國Thermo；共聚焦顯微鏡（LSM800），德國蔡司。

1.3 研究方法

1.3.1 人臍血MSCs 的培養(yǎng)和鑒定 無菌條件下取足月健康新生兒臍帶血10 ml（標(biāo)本采集獲得產(chǎn)婦和家屬同意，簽署知情同意書并獲湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會同意，批準(zhǔn)文號：HN-LL-KY-2020-013-01），用密度梯度離心得到單個核細(xì)胞，移入含5%胎牛血清、1%雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后換液，去除漂浮細(xì)胞，換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至第7 天，細(xì)胞生長達(dá)90%融合時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔2 d 換液1 次。取第3 代人臍血MSCs 于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，取第4 代分別進(jìn)行成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)分化鑒定。

1.3.2 最佳濃度GS-Rg1 的確定 收集對數(shù)生長期人臍血MSCs，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，置于96 孔板中，1×105個/孔；在37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁。在96 孔板中配制100 μl 的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h；然后向培養(yǎng)板分別加入0、5、10、20、40、80 mg/L GS-Rg1 與人臍血MSCs 進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)。經(jīng)孵育48 h 后，依據(jù)CCK-8 試劑盒說明書要求，用酶標(biāo)儀測定各濃度下細(xì)胞在450 nm 處的光密度（optical density，OD）值，并設(shè)置對照孔，每組設(shè)定3 個復(fù)孔，篩選出GS-Rg1 促人MSCs 增殖的最佳濃度。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 將第4 代人臍血MSCs 分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組用最佳濃度的GS-Rg1 處理；對照組用等體積的磷酸鹽緩沖液處理。

1.3.4 GS-Rg1 對人臍血MSCs 細(xì)胞活性的影響 將細(xì)胞置于37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞接種到96 孔板上，實(shí)驗(yàn)組中加入最佳濃度的GS-Rg1，對照組用等體積磷酸鹽液處理，將96 孔板中配制100 μl 的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h，再孵育24 h，向每孔加入10 μl CCK-8 溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，同時設(shè)置空白組，用酶標(biāo)儀測定各組在450 nm 處的OD 值，每組設(shè)定3 個復(fù)孔，細(xì)胞活性=[（實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）]×100%。

1.3.5 GS-Rg1 誘導(dǎo)人MSCs 體外血管生成實(shí)驗(yàn) 基質(zhì)膠4℃過夜溶解，移液槍槍頭盒、EP 管、96 孔板均4℃過夜預(yù)冷；第2 天于冰盒上鋪膠，50 μl/孔加入96 孔板，37℃孵箱放置30 min；當(dāng)人臍血MSCs 增殖至培養(yǎng)皿底部的80%～90%時，使用胰酶消化并重懸，每孔加入1 ml 重懸液，細(xì)胞密度達(dá)到1×105個/孔；實(shí)驗(yàn)組用最佳濃度GS-Rg1 加入基質(zhì)膠，對照組用等體積磷酸鹽緩沖液處理；37℃孵育，培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡下觀察并拍照3 張，選取最典型的圖片展示，采用Image J 分析內(nèi)皮細(xì)胞形成的管腔長度，管腔長度=主干長度+分支長度，成管長度取3 次平均值。

1.3.6 內(nèi)皮分化指標(biāo)CD31、vWF 測定 將載玻片放入培養(yǎng)板里，然后將2 ml 含有1×106個/ml 第4 代人臍血MSCs 懸液滴加在玻片上，加入最佳濃度GSRg1，48 h 后取出載玻片；放入-20℃冷丙酮中固定30 min，用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，2 min/次；滴加3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，2 min/次，0.5%Triton X-100 室溫通透20 min；磷酸鹽緩沖液浸洗3 次，3 min/次，吸干緩沖液，再滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸掉封閉液，每孔分別滴加CD31 及vWF 一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；磷酸鹽吐溫緩沖液浸洗細(xì)胞3 次，3 min/次，吸取一抗，再滴加稀釋后的熒光二抗，濕盒中孵育1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液浸洗3 次；滴加DAPI 避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，洗去DAPI；吸干液體，熒光顯微鏡下觀察采集圖像，使用Image-Pro Plus6.0 軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，是MSCs 的典型形態(tài)。見圖1。

圖1 光學(xué)顯微鏡下第3 代人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（200×）

2.2 第4 代細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果

成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)分化鑒定染色結(jié)果均可見大量深染色部分，顯示其為MSCs。見圖2。

圖2 人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成軟骨和成脂分化鑒定結(jié)果（400×）

2.3 不同濃度GS-Rg1 作用下人臍血MSCs 增殖能力比較

GS-Rg1 濃度為40、80 mg/L 時，人臍血MSCs OD值高于其濃度為0、5、10、20 mg/L 時，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。GS-Rg1 濃度為80 mg/L 時，人臍血MSCs OD 值與其濃度為40 mg/L 時比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度GS-Rg1 作用下人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力比較

2.4 兩組細(xì)胞活性比較

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性為（97.36±0.72）%，對照組細(xì)胞活性為（83.61±3.14）%，實(shí)驗(yàn)組高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.75，P ＜0.05）。

2.5 兩組體外成管情況

實(shí)驗(yàn)組可見網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，對照組則多為細(xì)胞分散存在，見圖4。實(shí)驗(yàn)組管腔長度長于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖5。

圖4 兩組體外成管情況

2.6 兩組CD31、vWF 熒光強(qiáng)度比較

實(shí)驗(yàn)組CD31、vWF 熒光強(qiáng)度強(qiáng)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖6。

圖6 兩組CD31、vWF 熒光強(qiáng)度比較

3 討論

GS-Rg1 是人參的重要活性組分之一，其生理活性作用極為廣泛，而在細(xì)胞層面上，具有上述類似功能的MSCs 為進(jìn)一步研究其相關(guān)機(jī)制開辟了新途徑。目前已有研究表明，GS-Rg1 可促進(jìn)人或動物組織來源的MSCs 增殖[10-11]、血管新生[12]，并能誘導(dǎo)MSCs 在不同環(huán)境中定向分化成各種體細(xì)胞。目前研究表明，GS-Rg1 可誘導(dǎo)MSCs 表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白及神經(jīng)生長因子，促進(jìn)MSCs 增殖及向神經(jīng)細(xì)胞分化[13]。Yin 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L的GS-Rg1 溶液可促進(jìn)人牙周膜源MSCs 增殖，上調(diào)MSCs 堿性磷酸酶、骨橋蛋白和骨鈣素等因子的表達(dá)，最終促進(jìn)人牙周膜源MSCs 的成骨分化。Xu 等[15]發(fā)現(xiàn)，GS-Rg1 可提高第3 代人乳腺脂肪源MSCs 增殖能力，且能促進(jìn)其向軟骨細(xì)胞分化。GS-Rg1 可通過上調(diào)Ⅱ型膠原、酸性磷酸酶及彈性蛋白mRNA 水平來促進(jìn)人乳腺脂肪源MSCs 向軟骨細(xì)胞分化。由此可知，在一定條件下GS-Rg1 可誘導(dǎo)不同來源MSCs 向神經(jīng)細(xì)胞、骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等定向分化。

MSCs 已經(jīng)被證明在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)及臨床中有促進(jìn)血管生成的作用。MSCs 血管生成特性可歸因于直接分化為內(nèi)皮細(xì)胞[16]和旁分泌效應(yīng)[17]。目前MSCs 主要的誘導(dǎo)分化方法包括外源性生長因子誘導(dǎo)MSCs 分化、基因修飾誘導(dǎo)MSCs 分化、將MSCs 與其他細(xì)胞共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)MSCs 分化等[18-19]。目前體外研究MSCs 向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化常使用的誘導(dǎo)因子有血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子及表皮生長因子等。其中血管內(nèi)皮生長因子是血管內(nèi)皮中最具特異性的分泌性生長因子，是正常血管形成和血管新生的必需調(diào)控因子[20-21]。此外，目前有多種中藥活性成分及復(fù)方能誘導(dǎo)MSCs 向內(nèi)皮細(xì)胞分化。周細(xì)胞是血管內(nèi)壁的重要構(gòu)件之一，能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，支撐血管的管腔結(jié)構(gòu)。黃芪甲苷可激活TGF/Smad2 途徑介導(dǎo)MSCs 分化為周細(xì)胞[22]。黃芪甲苷、丹參酮ⅡA 干預(yù)MSCs 后，能提高血管壁主要連接蛋白Cx37、Cx40 和Cx43 表達(dá)，促進(jìn)MSCs 分化為內(nèi)皮細(xì)胞[23]。由此可知，中藥可以促進(jìn)MSCs 定向分化成血管相關(guān)細(xì)胞。GS-Rg1 被證實(shí)能促進(jìn)血管新生，但GS-Rg1能否通過誘導(dǎo)MSCs 實(shí)現(xiàn)定向成血管分化，目前鮮見相關(guān)研究。

種宗雷等[24]通過研究不同濃度GS-Rg1 干預(yù)人臍帶MSCs 發(fā)現(xiàn)GS-Rg1 對其增殖有顯著的促進(jìn)作用，可減輕H2O2對人臍帶MSCs 的損傷。但該研究設(shè)置的低、中、高3 個劑量組分別為0.5、4.0、32.0 μmol/L，研究結(jié)果提示GS-Rg1 的濃度與人臍帶MSCs 的增殖呈正相關(guān)，而高劑量組32.0 μmol/L 不是促進(jìn)人臍帶MSCs 增殖的最佳濃度。本研究通過設(shè)置GS-Rg1 濃度梯度，研究其對人臍血MSCs 增殖功能的影響，發(fā)現(xiàn)GS-Rg1 促人臍血MSCs 增殖的最佳濃度為40 mg/L。進(jìn)一步研究結(jié)果提示GS-Rg1 對人臍血MSCs 的細(xì)胞活性有促進(jìn)作用，是具有制藥前景的細(xì)胞活性藥物。本研究結(jié)果提示，GS-Rg1 干預(yù)后人臍血MSCs 體外成管能力及表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31、vWF能力增強(qiáng)，為進(jìn)一步探尋GS-Rg1 干預(yù)人臍血MSCs 后發(fā)揮促進(jìn)血管新生的分子機(jī)制做鋪墊，并為未來GSRg1 更好地應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。然而，本研究未涉及分子通路和動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，GS-Rg1 促進(jìn)MSCs發(fā)揮血管新生功能的具體機(jī)制亟待更深入的研究。