李鵬程 趙 偉 張 洋 王 勇 包曉赫 董 宇 王 楠

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是世界上最嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，通常會導致嚴重的長期殘疾，給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，全球每年有超過25萬人患有脊髓損傷，且發(fā)生率仍在上升[2]。SCI患者功能恢復的常規(guī)干預措施包括藥物和手術(shù)等康復方法，但治療效果仍然不盡如人意[3]。目前，許多物理方法也通過維持微環(huán)境的穩(wěn)定性來加速神經(jīng)再生的速度和質(zhì)量。超短波(ultrashort wave，USW)通過刺激神經(jīng)血管的形成和神經(jīng)滋養(yǎng)來改善血液循環(huán)、抑制炎癥狀態(tài)、減輕腫脹、為軸突生長和施萬細胞增殖提供氧氣和營養(yǎng)，以及增強組織代謝和神經(jīng)系統(tǒng)功能[4]。本研究評估低劑量 USW對SCI的治療效果，以及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、缺氧誘導因子1-α(hypoxia inducible factors 1-α,HIF-1α)和Nogo-NgR通路相關(guān)基因及蛋白表達的影響，為臨床治療SCI提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.實驗動物：雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～220g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：12h晝夜交替、溫度22～25℃、濕度45%～50%，環(huán)境清潔，通風良好，自由攝食、飲水。本研究通過沈陽醫(yī)學院實驗動物倫理學委員會審批[倫理審批號：研倫審第(2020)47號]，實驗期間各項操作符合《實驗動物管理條例》。

2.試劑與儀器：TGF-β1抗體(sc-130348)購自美國Santa Cruz公司；HIF-1α抗體(sc-13515)購自美國Santa Cruz公司；Nogo-A抗體(13401S)購自美國Cell Signaling Technology公司；NgR抗體(ab172653)購自英國Abcam公司；GAPDH抗體(AF0003)、鼠單克隆抗體(AG019)購自中國Beyutime公司；蛋白提取試劑盒、總RNA提取試劑盒(DP419)購自中國TIANGEN公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒(DRR420A)購自大連TAKARA公司；USW裝置[使用頻率40.68MHz，最大輸出功率40W，電流強度60mA左右(DL-CII，編號BB1404069)]購自汕頭市醫(yī)療器械廠。

3.大鼠SCI模型建立及USW干預：30只大鼠隨機分成對照組、模型組和USW組，每組10只。1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，俯臥固定，備皮消毒，確定T10棘突位置，分離皮下組織和兩側(cè)肌肉，暴露T9～T11棘突。用咬骨鉗分離T10棘突，暴露脊髓T9～T11平面(面積約4mm×6mm)，對照組僅進行椎板咬除，脊髓無損傷，模型組和USW組采用改良的Allen撞擊裝置，5g 打擊棒從5cm高度自由落體下落并對脊髓進行撞擊。模型組不做任何治療；USW組在損傷24h后，將大鼠置于固定器中，將一對直徑為 4cm 的圓盤電極放置在大鼠脊髓傷口的兩側(cè)，距離皮膚2cm，每天接受7min的USW治療，直至第4周末處死。末次USW治療后，麻醉處死，獲取2cm受損脊髓組織，一部分組織經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，置于-80℃保存。

4.行為學評分：在實驗造模后的1周、2周、3周、4周，所有大鼠的神經(jīng)運動功能由兩名未參與本研究的技術(shù)人員使用運動評分量表(Basso-Beattie-Bresnahan，BBB)進行檢查，觀察時間為3分鐘/只。BBB 評分量表的范圍為0～21分，根據(jù)四肢運動的協(xié)調(diào)性、爪子的放置和尾部平衡等參數(shù)來判斷。其中0分表示沒有可觀察到的后肢功能，21分表示正常步態(tài)和功能齊全的后肢。同時進行斜板試驗：將大鼠身體軸線和斜板縱軸垂直后逐漸增大斜板坡度，當大鼠剛好能夠在斜板上停留5s，記錄此時坡度作為其肢體功能評分。

5.實時定量PCR檢測：取各組大鼠冰凍脊髓組織，并根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA。使用5×First Strand cDNA Synthesis Master Mix試劑盒合成第一鏈cDNA。最后應用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行實時定量PCR。擴增條件如下：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 60s，40個循環(huán)，72℃ 4min。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法對基因表達進行定量分析。所用PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，具體序列詳見表1。

表1 實時定量PCR的寡核苷酸引物列表

6.Western blot 法檢測：切碎脊髓組織，添加RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白含量后采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離的等量蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的Tris 緩沖鹽水中的封閉，分別加入稀釋后的一抗(TGF-β1、HIF-1α、Nogo-A、NgR、GAPDH)4℃孵育過夜，洗膜后添加稀釋后的二抗于室溫下孵育1h，洗膜后采用電化學發(fā)光顯影，并在凝膠成像儀獲取圖像。

結(jié) 果

1.小劑量USW治療對大鼠BBB評分影響：對照組大鼠各時間點的BBB評分均在20分以上，表示基本無后肢運動障礙。與對照組比較，模型組各時間點的BBB評分降低(P<0.05)；與模型組比較，USW組各時間點的BBB評分升高(P<0.05)，但低于對照組(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠BBB評分比較分)

2.小劑量USW治療對大鼠斜板評分影響：對照組大鼠各時間點的斜板評分均在65分以上。與對照組比較，模型組大鼠各時間點的斜板評分降低(P<0.05)；與模型組比較，各時間點USW組大鼠斜板評分升高(P<0.05)，但低于對照組(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠斜板評分比較分)

3.小劑量USW治療對大鼠TGF-β1、HIF-1α的影響：對照組TGF-β1和HIF-1α mRNA低水平表達。與對照組比較，模型組TGF-β1和HIF-1α mRNA表達較對照組升高(P<0.05)；USW組TGF-β1和HIF-1α mRNA較模型組降低(P<0.05)，但高于對照組(P<0.05)。TGF-β1和HIF-1α蛋白表達與mRNA結(jié)果一致，詳見圖1。

圖1 各組TGF-β1和HIF-1α蛋白表達A.TGF-β1、HIF-1α蛋白表達水平；B.TGF-β1mRNA相對表達量；C.HIF-1α mRNA相對表達量。與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4.小劑量USW治療對大鼠Nogo-NgR通路的影響：對照組Nogo-A和NgR mRNA低水平表達。模型組Nogo-A和NgR mRNA表達較對照組升高(P<0.05)；USW組Nogo-A和NgR mRNA較模型組降低(P<0.05)，但高于對照組(P<0.05)。Nogo-A和NgR蛋白表達與mRNA結(jié)果一致，詳見圖2。

圖2 各組Nogo-A和NgR蛋白表達A.Nogo-A、NgR蛋白表達水平；B.Nogo-A mRNA相對表達量；C.NgR mRNA相對表達量。與對照組比較, *P<0.05;與模型組比較, #P<0.05

討 論

SCI是一種常見的臨床疾病，常導致四肢癱瘓[5]。脊髓損傷后通常伴隨著自發(fā)性和可塑性的軸突再生，有助于改善感覺和運動功能，但軸突再生是有限的[6]。脊髓損傷后的自然恢復需要持續(xù)數(shù)年，且恢復的效果不佳[7]。因此，開發(fā)可以加速恢復運動功能的新方法對于脊髓受損患者來說是重中之重。

超短波是一種高頻電磁波，具有穿透性強、作用部位深的特點，產(chǎn)生明顯的溫熱效應，目前作為一種治療方法，廣泛用于物理治療、康復醫(yī)學以及神經(jīng)再生[8]。多項證據(jù)表明，超短波在脊髓損傷后修復發(fā)揮積極的促進作用。高琳等[9]研究表明，超短波可以調(diào)控大鼠脊髓損傷后巨噬細胞極化，繼而抑制炎性反應并促進脊髓損傷。Yin等[10]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞移植聯(lián)合USW輻射在促進 SCI 后功能恢復方面比單獨治療更有效，這可能是由于同時抑制炎癥和脊髓水腫，進而并促進神經(jīng)功能恢復。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)，USW通過抑制MK2促進 SCI 恢復和減輕 SCI 后的炎性反應[11]。BBB評分以及斜板評分是用來評價SCI大鼠后肢功能恢復程度的指標[12,13]。本研究中，超短波治療后能夠明顯提高脊髓損傷后大鼠的BBB評分以及斜板評分，表明USW療法對脊髓損傷有效。

脊髓損傷會在原始損傷部位和外部引發(fā)復雜的炎性反應，并加重組織損傷[14]。生長轉(zhuǎn)化因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)廣泛參與體內(nèi)各種病理生理過程，與炎癥、創(chuàng)傷等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。研究表明，急性脊髓損傷后TGF-β1表達增加，可能與其具有免疫抑制、炎癥抑制的作用相關(guān)，是身體對神經(jīng)損傷的自我保護反應[15]。Lei[16]研究發(fā)現(xiàn)，楊梅苷能夠部分通過TGF-β信號通路下調(diào)COX-2、TGF-β1、p53，從而發(fā)揮抗氧化和抗炎作用，促進SCI 大鼠的功能恢復。HIF-1α是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與血管生成、細胞凋亡的生物學過程。研究報道，SCI 后的急性和慢性反應期，HIF-1α及其靶基因如血管生成分子的表達增加，在28天達到峰值，且HIF-1α mRNA及蛋白的表達情況與損傷情況和預后密切相關(guān)[17]。本實驗中在脊髓損傷后的24h給予低劑量USW治療，能夠有效降低大鼠脊髓組織中HIF-1α和TGF-β1 mRNA及蛋白的表達，表明低劑量USW治療能夠有效改善改善血液循環(huán)、抑制炎癥狀態(tài)。

Nogo-A是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘中發(fā)現(xiàn)的Nogo家族的一員，已被確定為限制軸突再生的關(guān)鍵分子。脊髓損傷后，少突膠質(zhì)細胞和髓鞘將細胞內(nèi)Nogo-A釋放到細胞外基質(zhì)中，并抑制軸突再生。研究表明，在體內(nèi)應用的Nogo-A抗體不僅可以中和Nogo-A在少突膠質(zhì)細胞和髓磷脂中表達的抑制功能，而且可以直接積極地增強神經(jīng)元的再生[18]。NgR是Nogo-A的受體，在脊髓損傷后再生抑制信號轉(zhuǎn)導中起重要作用，而NgR的表達與中樞神經(jīng)細胞再生能力直接相關(guān)，因此NgR被認為是其中之一促進軸突再生的重要靶點。研究報道，內(nèi)源性NgR拮抗劑的缺失導致SCI后功能恢復的顯著延遲，而過表達內(nèi)源性NgR拮抗劑顯著促進視神經(jīng)和脊髓損傷后的軸突再生[19]。此外，Nogo-A與NgR結(jié)合后，將信息傳遞給神經(jīng)細胞，生成NgR/p75NTR/LINGO-1復合物，進一步介導軸突生長抑制[20]。因此，Nogo/NgR信號通路在SCI后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元和軸突的再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究檢測了Nogo-A與NgR基因和蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，低劑量USW治療顯著降低損傷脊髓組織Nogo-A與NgR基因和蛋白的表達，表明USW可能通過負性調(diào)控Nogo-NgR通路對脊髓損傷起到修復作用。

綜上所述，低劑量USW能夠通過下調(diào)脊髓Nogo/NgR的信號通路中Nogo-A與NgR mRNA及蛋白的表達，減輕局部缺氧環(huán)境，降低炎性反應，進而加快脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復，為臨床應用提供了較好的理論依據(jù)。