殷藝娜，馬敏，?？?，孔玉芳，芮琳琳，褚國強

（1.南京醫(yī)科大學附屬常州婦幼保健院 麻醉科，江蘇 常州213003；2.南通大學附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 南通226001；3.南京醫(yī)科大學附屬常州婦幼保健院 保健科，江蘇 常州213003）

氯胺酮作為N-甲基-D-天冬氨酸受體的非競爭性拮抗劑，因其獨特的麻醉特性，被廣泛應用于產(chǎn)科和小兒外科的手術麻醉[1]。嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期是神經(jīng)系統(tǒng)最脆弱、最容易受到損害的時期，全身麻醉藥物是否影響患兒的大腦發(fā)育及學習記憶功能一直是臨床及科研工作者關注的熱點[2]。以往對于氯胺酮致發(fā)育期神經(jīng)毒性的研究主要集中在神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)炎癥等方面[3]，對小膠質(zhì)細胞在其中發(fā)揮的作用研究較少。因此，本研究旨在進一步探究氯胺酮致發(fā)育期神經(jīng)毒性作用機制是否與小膠質(zhì)細胞發(fā)育及功能改變有關，以期為氯胺酮致發(fā)育期神經(jīng)毒性作用機制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年昆明小鼠置于室溫（25±1）℃、濕度20%～30%的動物房中分籠飼養(yǎng)，12 h 晝/夜循環(huán)照明，自由攝食、攝水。適應性飼養(yǎng)1周，每天下午4:00～6:00 按照雌雄比例2∶1～3∶1 合籠交配，使母鼠受孕，合籠后第2～6 天上午檢查陰道栓子有無脫落。母鼠受孕后陰道口可見乳白色陰道栓，此時記為孕0.5（E0.5）。孕鼠自然分娩即新生小鼠出生當日記為P0，新生小鼠斷奶前（出生后21～24 d）母鼠喂養(yǎng)，斷奶后普通飼料喂養(yǎng)。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2017-0007，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2017-0044。本動物實驗經(jīng)南京醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批通過。

1.2 實驗分組

將出生后6 d（P6）的同窩昆明小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和氯胺酮組，每組36只。兩組采用腹腔注射給藥方式，氯胺酮單次給藥劑量為80 mg/kg，對照組每次注射與氯胺酮組等體積的生理鹽水。兩組每天下午2:00 注射1 次，連續(xù)注射5 d。兩組動物每次注射完畢后，分別放入單獨鼠籠中，各項操作輕柔，密切注意小鼠皮膚顏色變化，防止發(fā)生低氧血癥，待小鼠翻正反射恢復后放回原來的鼠籠。

1.3 主要試劑與儀器

鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)有限公司），0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司），羊Iba1多克隆抗體（美國Abcam 公司），Alexa Flour 546 驢抗山羊IgG（美國Invitrogen 公司），兔CX3CR1 單克隆抗體（美國Abcam 公司），鼠β-actin 多克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）。Morris 水迷宮（上海吉量軟件科技公司），ChemiDocTM XRS + 凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司），冷凍切片機（德國Leica 公司），顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.4 方法

1.4.1 水迷宮測試 兩組小鼠給藥1 個月和2 個月后分別取20 只行Morris 水迷宮實驗。實驗在直徑100 cm、水深40 cm 的圓形水池中進行，水溫維持在（20±1）℃。將直徑6 cm 的圓形平臺放入目標象限，并隱匿于水面下1 cm 處。實驗前1 d，將小鼠放入迷宮水池中自由游行1 min，使其適應水池及周圍環(huán)境。前期訓練共持續(xù)5 d，自第1 天起，每天下午2:00 開始訓練，將小鼠頭朝向水池壁，從第一象限開始，依次從4 個象限的入水點放入水中，記錄小鼠入水至爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期；若小鼠60 s 未爬上平臺統(tǒng)一按照60 s 計算，并由實驗者將其引導上平臺并停留15 s，反映被測小鼠的學習能力。第6 天進行定向航行實驗，將小鼠于平臺對側(cè)象限入水點放入水中，記錄小鼠入水到爬上平臺所需時間；若小鼠60 s 內(nèi)未爬上平臺則統(tǒng)一按照60 s 計算。然后撤去平臺，將小鼠于平臺對側(cè)象限入水點放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)搜索平臺的路線圖、目的象限停留時間及穿臺次數(shù)，反映小鼠學會尋找平臺后，對平臺的空間位置記憶能力。

1.4.2 免疫熒光染色 選取P11、P16、P21、P35、P67 小鼠各8 只，腹腔注射水合氯醛350 mg/kg 麻醉，固定四肢，開胸暴露心臟，由左心室心尖部插入頭皮針至升主動脈，剪開右心耳，快速灌注肝素、生理鹽水，直至肝臟變白，右心耳流出的液體透明，再以4%多聚甲醛灌注，直至下肢、鼠尾變硬，隨即斷頭、取腦。將全部腦組織置于4℃、4%多聚甲醛固定24 h 后取出，置于30%蔗糖脫水，直至組織沉底。用濾紙吸干腦組織表面水分，放入包埋劑內(nèi)，置于-20℃冷凍切片機中速凍60 min，調(diào)整切片厚度為40 μm，采取冠狀位連續(xù)切片，以海馬前聯(lián)合為標記點，采用Iba1 對小鼠海馬齒狀回小膠質(zhì)細胞進行標記。順序選取其后第6～15 張含海馬區(qū)切片，置于0.01 mol/L PBS 液內(nèi)備用。將腦組織切片用0.01 mol/L PBS 搖床洗滌3 次，5 min/次；3%BSA 常溫封閉1 h。一抗孵育：羊源DCX（1∶200，0.4 % PBST 稀釋）4℃搖床孵育24 h；0.01 mol/L PBS搖床洗滌3 次，5 min/次；二抗孵育：Alexa Flour 546 標記的驢抗山羊IgG（1∶200，0.4%PBST 稀釋）室溫避光孵育2 h；0.01 mol/L PBS 搖床洗滌3 次，5 min/次，進行貼片并晾干切片，全程避光；每張載玻片上均勻滴入DAPI 染液100 μl，染色10 min后PBS 沖洗并晾干，全程避光；防淬滅封片劑封片，置于FV1000 激光共聚焦顯微鏡下，用Olympus Fluoview Ver.4.2a 軟件觀察和拍片，在Image-Pro Plus 軟件下手動計數(shù)細胞，計算每個20 倍物鏡視野下（620 μm×620 μm）海馬齒狀回區(qū)域Iba1 陽性細胞數(shù)，并計算每平方毫米Iba1 陽性細胞數(shù)。計數(shù)過程中采用盲法，圖像分析軟件的分析參數(shù)一致。

1.4.3 Western blotting檢測CX3CR1蛋白 小膠質(zhì)細胞發(fā)育、成熟過程中受許多因素影響，CX3CR1是小膠質(zhì)細胞發(fā)育、成熟過程中的“特征”因子[4-5]。選取P11、P16、P21、P35、P67 小鼠各8只，直接斷頭后置于冰上取腦，迅速分離出雙側(cè)海馬組織，分別取RIPA 蛋白裂解液和100 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑，按照100∶1 比例混合。稱取組織重量，按照每100 mg 組織加入100 μl 蛋白裂解液的比例加入適量裂解液，在冰上進行組織勻漿。4℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液。BCA 法測定樣本蛋白濃度后，各組用裂解液配平。加入5×上樣緩沖液，沸水變性5 min。各組取等量樣本蛋白在12% SDS-PAGE 凝膠系統(tǒng)上樣，先恒壓80 V至溴酚藍跑到濃縮膠與分離膠分界處，再恒壓120 V使溴酚藍跑至底部。跑完電泳后，進行半干轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，搖床上溫和振蕩，3% BSA 常溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。復溫后Washing Buffer 洗滌3 次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記二抗，搖床上溫和振蕩，常溫孵育2 h。Washing Buffer 洗滌3 次，5 min/次。膜上滴適量ECL 發(fā)光液，將膜放入凝膠成像儀，采用化學發(fā)光法檢測并采集圖像。用Image J 圖像分析軟件對所得條帶進行光密度掃描，各組CX3CR1 蛋白條帶光密度值與內(nèi)參蛋白光密度值的比值為CX3CR1 蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 和Graph Pad Prism 6 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用t檢驗或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組學齡期小鼠水迷宮行為學變化

氯胺酮組與對照組學齡期小鼠訓練前第1 天、第2 天、第3 天、第4 天、第5 天逃避潛伏期比較，采用重復測量設計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點學齡期小鼠逃避潛伏期有差異（F=34.213，P=0.000）。②氯胺酮組與對照組學齡期小鼠逃避潛伏期有差異（F=19.856，P=0.000）；氯胺酮組與對照組相比逃避潛伏期較長（P<0.05），多次氯胺酮麻醉可能導致學齡期小鼠學習記憶功能障礙。③兩組學齡期小鼠逃避潛伏期變化趨勢有差異（F=12.436，P=0.000）。見表1。

表1 兩組學齡期小鼠不同時間點的逃避潛伏期變化（n=20，s，±s）

組別對照組氯胺酮組t 值P 值第1天41.7±7.8 43.9±5.4 1.037 0.304第2天33.4±10.3 39.9±7.7 2.260 0.030第3天29.5±8.8 38.2±7.4 3.384 0.002第4天24.5±8.8 33.2±7.4 3.384 0.002第5天20.7±7.4 30.7±10.1 3.572 0.001

在第6 天的空間探索實驗中，氯胺酮組與對照組學齡期小鼠60 s 內(nèi)穿臺次數(shù)、目的象限活動時間占比比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），對照組高于氯胺酮組。見表2。

表2 兩組學齡期小鼠60 s內(nèi)穿臺次數(shù)和目的象限活動時間比較 （n=20，±s）

表2 兩組學齡期小鼠60 s內(nèi)穿臺次數(shù)和目的象限活動時間比較 （n=20，±s）

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2.2 兩組成年小鼠水迷宮行為學變化

氯胺酮組與對照組成年小鼠訓練前第1 天、第2 天、第3 天、第4 天、第5 天逃避潛伏期比較，采用重復測量設計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點成年小鼠逃避潛伏期有差異（F=41.527，P=0.000）。②氯胺酮組與對照組成年小鼠逃避潛伏期有差異（F=21.365，P=0.000）；氯胺酮組與對照組相比逃避潛伏期較長（P<0.05），多次氯胺酮麻醉可能導致學習記憶功能障礙。③兩組成年小鼠逃避潛伏期變化趨勢有差異（F=17.548，P=0.000）。見表3。

表3 兩組成年小鼠不同時間點的逃避潛伏期變化 （n=20，s，±s）

表3 兩組成年小鼠不同時間點的逃避潛伏期變化 （n=20，s，±s）

組別對照組氯胺酮組t 值P 值第1天43.1±7.1 45.2±9.3 0.803 0.440第2天34.6±10.1 38.9±10.1 1.346 0.190第3天26.5±10.0 34.4±6.9 2.908 0.006第4天24.8±6.4 33.4±9.1 3.457 0.001第5天18.6±7.0 30.4±12.5 3.683 0.001

在第6 天的空間探索實驗中，氯胺酮組與對照組成年小鼠60 s 內(nèi)穿臺次數(shù)、目的象限活動時間占比比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），對照組高于氯胺酮組。見表4。

表4 兩組成年小鼠60 s內(nèi)穿臺次數(shù)和目的象限活動時間占比比較 （n=20，±s）

表4 兩組成年小鼠60 s內(nèi)穿臺次數(shù)和目的象限活動時間占比比較 （n=20，±s）

組別對照組氯胺酮組t值P值穿臺次數(shù)2.7±1.3 1.7±1.1 2.626 0.011目的象限活動時間占比/%27.2±11.1 21.3±6.7 2.035 0.049

2.3 兩組小鼠海馬齒狀回小膠質(zhì)細胞數(shù)變化

氯胺酮組與對照組P11、P16、P21、P35、P67小鼠海馬齒狀回小膠質(zhì)細胞數(shù)比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），對照組均多于氯胺酮組。見表5 和圖1。

圖1 兩組不同階段小鼠海馬齒狀回小膠質(zhì)細胞 （免疫熒光染色×20）

表5 兩組不同階段小鼠海馬齒狀回小膠質(zhì)細胞數(shù)比較 （n=8，個/mm2，±s）

表5 兩組不同階段小鼠海馬齒狀回小膠質(zhì)細胞數(shù)比較 （n=8，個/mm2，±s）

組別對照組氯胺酮組t 值P 值P11 255.8±17.2 237.2±17.1 3.068 0.004 P16 277.3±15.5 256.6±18.9 3.387 0.002 P21 236.1±21.2 210.9±22.6 3.353 0.003 P35 205.5±12.5 194.5±15.3 2.227 0.033 P67 199.1±14.0 185.9±15.1 2.564 0.016

2.4 兩組小鼠雙側(cè)海馬組織CX3CR1蛋白相對表達量變化

氯胺酮組與對照組P11、P16、P21、P35、P67小鼠雙側(cè)海馬組織CX3CR1 蛋白相對表達量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），對照組高于氯胺酮組。見表6 和圖2。

圖2 兩組不同階段小鼠雙側(cè)海馬組織CX3CR1蛋白相對表達量變化 （n=8，±s）

表6 兩組不同階段小鼠雙側(cè)海馬組織CX3CR1蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

表6 兩組不同階段小鼠雙側(cè)海馬組織CX3CR1蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

組別對照組氯胺酮組t 值P 值P11 0.75±0.17 0.55±0.17 2.353 0.033 P16 1.05±0.11 0.85±0.12 3.475 0.004 P21 0.83±0.14 0.64±0.10 3.124 0.007 P35 0.94±0.16 0.73±0.21 2.250 0.038 P67 0.70±0.12 0.53±0.16 2.404 0.029

3 討論

嬰幼兒階段是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的高峰期和敏感期，與成人相比更易受到麻醉藥物的損害[6]。嚙齒類動物與靈長類動物的研究表明，氯胺酮的大劑量使用或者持續(xù)暴露可以誘導發(fā)育期大腦神經(jīng)細胞變性和凋亡，導致認知功能障礙[7-8]。因此，有人認為氯胺酮只有在作用時間足夠長，濃度足夠大時才會引起神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和認知功能損害[7]。

有研究顯示，小鼠氯胺酮產(chǎn)生麻醉狀態(tài)的半數(shù)有效量是80 mg/kg[9-10]，據(jù)此筆者進行了預實驗，最終確定氯胺酮腹腔注射麻醉劑量為80 mg/kg。嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期是神經(jīng)系統(tǒng)最脆弱、最容易受到損害的時期，故本研究中氯胺酮的給藥時段設在大腦發(fā)育高峰期及小膠質(zhì)細胞增殖、發(fā)育高峰時期，約出生后2 周左右[11]。前期預實驗選擇出生后6 d 小鼠腹腔注射氯胺酮80 mg/（kg·d）或同等體積生理鹽水，并分設連續(xù)給藥1 次、3 次和5 次實驗組，以確定腹腔注射氯胺酮80 mg/（kg·d）劑量下，給藥次數(shù)對小鼠遠期認知功能的影響。選取出生后6 d 小鼠1 次或連續(xù)3 次給藥，1 個月后Morris 水迷宮實驗檢測兩組小鼠逃避潛伏期、穿臺次數(shù)、目的象限活動時間占比等無差異，說明新生期小鼠氯胺酮1 次或連續(xù)3 次暴露不足以造成長期空間學習記憶功能改變。由此本研究最終確定采用新生期小鼠連續(xù)5 次氯胺酮麻醉這一實驗劑量。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫效應細胞，對于維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮了不可替代的作用[12]，如參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、促進神經(jīng)環(huán)路形成、影響神經(jīng)元活動、清除病原體及吞噬凋亡的神經(jīng)元[13]等。關于全身麻醉藥物對小膠質(zhì)細胞數(shù)量、形態(tài)及功能的影響目前還沒有明確結(jié)論。有研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，腦組織內(nèi)炎癥因子明顯增加，小膠質(zhì)細胞持續(xù)活化，促使小膠質(zhì)細胞吞噬增加，加快了突觸退化和過度萎縮，導致小鼠認知障礙[14]。有趣的是，景勝等[15]的研究表明，出生后7 d 小鼠腹腔注射丙泊酚后海馬齒狀回小膠質(zhì)細胞數(shù)減少并且抑制了小膠質(zhì)細胞活化，這與SHEN 等[16]的結(jié)果相反。筆者猜測這些研究結(jié)果相反可能與藥物、劑量、實驗模型不同有關。本研究結(jié)果顯示，新生期小鼠5 次氯胺酮麻醉后，P11、P16、P21、P35、P67 小鼠海馬齒狀回Iba1 陽性標記的小膠質(zhì)細胞數(shù)明顯減少，推測氯胺酮神經(jīng)毒性可能抑制了小膠質(zhì)細胞增殖。

CX3CR1 是趨化因子CX3CL1 的受體，在腦內(nèi)的特異性由小膠質(zhì)細胞表達[4-5]。CX3CR1 不僅影響發(fā)育期小膠質(zhì)細胞的分化成熟，對小膠質(zhì)細胞的形態(tài)及功能的維持也具有重要作用[17]。此外，CX3CL1/CX3CR1 也是神經(jīng)元與小膠質(zhì)細胞之間重要的信號傳導通路，參與調(diào)節(jié)機體許多生理過程，包括維持神經(jīng)元存活、突觸連接的成熟、突觸傳遞及可塑性調(diào)節(jié)等[18-19]。有研究表明，成年小鼠敲除CX3CR1基因后，海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，突觸修剪被推遲，這種突觸修剪作用的缺陷會造成樹突棘增多，認知功能受損，提示小膠質(zhì)細胞減少可能通過CX3CL1/CX3CR1 信號通路導致突觸發(fā)育異常及認知功能障礙[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，P6 小鼠多次氯胺酮麻醉后海馬齒狀回區(qū)域Iba1 標記的小膠質(zhì)細胞數(shù)減少，且海馬區(qū)CX3CR1 蛋白相對表達量減少。筆者推測小膠質(zhì)細胞發(fā)育抑制，導致CX3CR1 蛋白相對表達量減少，相關信號通路異常，最終影響認知功能。

綜上所述，新生期小鼠多次氯胺酮麻醉致其學齡期及成年后認知功能障礙，海馬齒狀回小膠質(zhì)細胞和海馬區(qū)CX3CR1 蛋白相對表達量減少對其有促進作用。這為下一步麻醉藥的神經(jīng)毒性研究提供了新方向，也為麻醉藥物在發(fā)育期的安全應用提供一些指導。