王丹丹 金保方 邢棟 劉媛媛 蔡濱 鄧偉民 崔毓桂 孫大林▲

睪酮（Testosterone，T）是由睪丸和腎上腺產(chǎn)生的雄激素，對(duì)肌肉、骨骼、毛發(fā)以及性功能都有影響。睪酮水平降低會(huì)產(chǎn)生乏力、注意力不集中、抑郁、性欲低下和勃起功能障礙等癥狀。外源性補(bǔ)充睪酮是目前臨床常用的治療方法，但其不良反應(yīng)多，且會(huì)降低男性精子生成和生育能力[1]。其中，游離睪酮（Free testosterone，F(xiàn)T）代表雄激素的活性形式[2]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long noncoding RNAs，LncRNAs）是一類不具備蛋白翻譯功能、長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本。LncRNA H19位于人類第11號(hào)染色體，全長(zhǎng)2.3 kb。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，H19可以促進(jìn)類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）表達(dá)和睪酮的生成。StAR是類固醇激素生成的關(guān)鍵酶，可以將膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜[5]，隨后經(jīng)過線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中相關(guān)酶的催化進(jìn)而轉(zhuǎn)化為睪酮。

養(yǎng)精膠囊是用于睪酮低下引起性功能障礙及男性不育的醫(yī)院制劑。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)精膠囊能夠提高StAR啟動(dòng)子活性從而增加睪酮合成，但關(guān)于其上游的調(diào)控機(jī)制仍不明確。由于H19在睪酮合成中具有重要作用，養(yǎng)精膠囊可能是通過LncRNA H19調(diào)控StAR進(jìn)而發(fā)揮作用，但目前尚無相關(guān)報(bào)道。本研究旨在進(jìn)一步探索養(yǎng)精膠囊對(duì)LncRNA H19表達(dá)的影響，探討其促進(jìn)睪酮合成的機(jī)制，具有重要意義。

1 資料及方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)小鼠間質(zhì)細(xì)胞（Leydig細(xì)胞）系MLTC-1，購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，用RPMI-1640培養(yǎng)基（凱基生物，KGM31800-500），加入10%胎牛血清（ScienCell，0500）配成完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物養(yǎng)精膠囊（由淫羊藿、熟地黃、紫河車、沙苑子、黃精、牡蠣、當(dāng)歸、黃芪、王不留行、水蛭、荔枝核按1：1：1：1：2：2：1：2：2：1：1組成）來自南京軍區(qū)總醫(yī)院制劑科〔院臨（2004）第01002號(hào)〕，其水提物提取方法見參考文獻(xiàn)[7]。實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI-1640培養(yǎng)基按比例稀釋為低、中、高3種濃度梯度，分別相當(dāng)于生藥量0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL。

1.3 主要試劑0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco，2186976）；磷酸鹽緩沖液（Servicebio，G4202-500ML）；RNA快速提取試劑盒（ES Science，RN001）；焦碳酸二乙酯水（Beytime，R0021）；PrimeScript? RT Master Mix（Takara，RR036A）；TB Green? Premix Ex Taq?（Takara，RR420A）；RIPA裂解液（Thermo，#89900）；蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物（Thermo，VB298680）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Beytime，P0010）；Laemmli樣品緩沖液（Bio-rad，#161037）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beytime，P0012A）；PageRuler? Prestained Protein Ladder,10 to 180 kDa（Thermo，26616）；StAR Polyclonal antibody（Proteintech，12225-1-AP）；β-actin抗體（Proteintech，20536-1-AP）；山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標(biāo)記（Abcam，ab7090）；通用型抗體稀釋液（新賽美，WB500D）；超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（US EVERBRIGHT INC，S6009）；小鼠睪酮ELISA試劑盒（上海紀(jì)寧，A00550）；小鼠游離睪酮ELISA試劑盒（上海紀(jì)寧，JN17549-S）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器超凈臺(tái)；培養(yǎng)箱；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendorf AG，5404）；核酸蛋白測(cè)定儀（Eppendorf AG，6132）；PCR儀（applied biosystems，9902）；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（applied biosystems）；酶標(biāo)儀（Thermo，1510）；垂直電泳系統(tǒng)（Bio-rad，PowerPac? Basic）；曝光機(jī)（Tanon，5200）。

1.5 藥物干預(yù)及分組6孔板內(nèi)接種2×105個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，分別加入2 mL的培養(yǎng)基以及終濃度為0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL的養(yǎng)精膠囊水提物，并將其分別作為對(duì)照組和養(yǎng)精膠囊低、中、高劑量組。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 細(xì)胞上清T和FT濃度 上藥處理24 h后，胰酶消化細(xì)胞2 min，完全培養(yǎng)基中和，再1000 g離心20 min，取上清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)，按照ELISA試劑盒說明書操作，最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞上清中T和FT濃度。

1.6.2 mRNA相對(duì)表達(dá)量 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)。用試劑盒提取細(xì)胞總RNA，之后用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度，隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，最后以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。所用引物由南京銳真生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，詳見表1。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行加樣操作，反應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)兩步法，以2-△△CT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量[8]。

表1 H19、StAR、β-actin引物序列

1.6.3 StAR蛋白水平 采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）進(jìn)行檢測(cè)。胰酶消化細(xì)胞離心去上清后，加入RIPA Buffer裂解細(xì)胞，選擇BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，確定上樣量30 μg，加入2×上樣緩沖液，煮蛋白制樣；制備10% SDS-PAGE凝膠，上樣后電泳（壓縮膠80 V、分離膠120 V），隨后用PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入StAR抗體（1:1000）、β-actin抗體（1:2000）后于4 ℃冰箱過夜，TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的兔二抗（1:5000）室溫孵育1 h，最后加顯影液曝光。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。符合正態(tài)分布的兩組定量數(shù)據(jù)，采用雙尾t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究結(jié)果均為至少進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得。

2.1 養(yǎng)精膠囊處理MLTC-1后細(xì)胞上清T和FT水平的變化ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，養(yǎng)精膠囊高劑量組可提高M(jìn)LTC-1細(xì)胞上清睪酮濃度（見圖1A）和游離睪酮濃度（見圖1B），與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 養(yǎng)精膠囊對(duì)MLTC-1細(xì)胞上清T和FT水平的影響

2.2 養(yǎng)精膠囊處理MLTC-1細(xì)胞后StAR mRNA和蛋白水平的變化qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，養(yǎng)精膠囊各劑量組均能明顯提高StAR的轉(zhuǎn)錄水平，增加StAR mRNA的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），見圖2A。Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，隨著養(yǎng)精膠囊劑量的增加，StAR蛋白的表達(dá)增加，且低、高劑量組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2B。

圖2 養(yǎng)精膠囊對(duì)MLTC-1細(xì)胞中StAR mRNA和蛋白的影響

2.3 養(yǎng)精膠囊處理MLTC-1細(xì)胞后LncRNA H19 mRNA水平的變化qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，隨著養(yǎng)精膠囊劑量的增加，H19 mRNA的表達(dá)上調(diào)，且養(yǎng)精膠囊中、高劑量組能夠顯著提高H19的轉(zhuǎn)錄水平，增加H19 mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 養(yǎng)精膠囊對(duì)MLTC-1細(xì)胞中LncRNA H19 mRNA的影響

3 討論

睪酮大部分由睪丸Leydig細(xì)胞分泌，并受下丘腦-垂體-性腺軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。Leydig細(xì)胞位于生精小管之間的間質(zhì)內(nèi)，在垂體分泌的黃體生成素刺激下產(chǎn)生睪酮，進(jìn)而維持男性第二性征并調(diào)節(jié)男性生殖功能?？偛G酮包括游離睪酮和與蛋白質(zhì)結(jié)合的睪酮，后者可與性激素結(jié)合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）高親和力結(jié)合，與白蛋白、皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白及類黏蛋白（orosomucoid，ORM）低親和力結(jié)合。其中，與白蛋白低親和力結(jié)合的睪酮容易發(fā)生解離，與游離睪酮共同構(gòu)成生物可利用睪酮，在雄激素依賴性靶組織中具有生物活性。未與任何血漿蛋白結(jié)合的循環(huán)睪酮部分稱為游離睪酮。由于SHBG水平隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，因此與年齡相關(guān)的游離睪酮水平下降幅度大于總睪酮水平下降幅度。研究[9]顯示，游離睪酮與遲發(fā)性性腺功能減退癥的相關(guān)性強(qiáng)于總睪酮。然而，游離睪酮目前的測(cè)定方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，通過SHBG、白蛋白和總睪酮計(jì)算游離睪酮是相對(duì)準(zhǔn)確的[10]。采用ELISA測(cè)定游離睪酮，雖缺乏一定的準(zhǔn)確性，但亦能在一定程度上說明問題[11]。

LncRNA H19是目前已報(bào)道的少數(shù)印跡基因之一，在進(jìn)化上高度保守。胚胎發(fā)育期，H19在內(nèi)胚層和中胚層組織中高度表達(dá)，出生后主要在骨骼肌、心肌、乳腺、卵巢、子宮和睪丸中表達(dá)。H19在腫瘤進(jìn)展、能量代謝和機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[12]。近年來，多項(xiàng)研究報(bào)道了H19在類固醇激素合成方面的作用，發(fā)現(xiàn)H19內(nèi)含4個(gè)microRNA Let-7的結(jié)合位點(diǎn)，可以像“分子海綿”一樣通過結(jié)合“吸附”Let-7，抑制其功能[13]，進(jìn)而解除翻譯抑制和mRNA激活，從而促進(jìn)靶基因StAR的表達(dá)和孕酮的生成[14]。Chen等[4]通過敲除雌性小鼠卵巢組織內(nèi)H19基因，導(dǎo)致類固醇合成酶CYP17和睪酮的合成均顯著下調(diào)，證實(shí)了H19在調(diào)控睪酮合成方面具有重要作用。

養(yǎng)精膠囊是基于中醫(yī)“腎藏精，主生殖”理論，結(jié)合肝腎同源、精血互生的思路而設(shè)，具有益腎養(yǎng)精、補(bǔ)血活血的功效。養(yǎng)精膠囊由淫羊藿、熟地黃、紫河車、沙苑子、黃精、牡蠣、當(dāng)歸、黃芪、王不留行、水蛭、荔枝核組成。其中，淫羊藿性溫，味辛、甘，可補(bǔ)腎溫陽、強(qiáng)筋散濕；熟地黃性溫，味甘，可益精填髓、滋陰補(bǔ)血，兩者均入肝腎經(jīng)，陰陽雙補(bǔ)，互生互化，共為君藥。紫河車補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血；黃精健脾補(bǔ)腎、氣陰雙補(bǔ)；沙苑子益腎養(yǎng)肝、固精明目；牡蠣潛陽補(bǔ)陰，重鎮(zhèn)安神；黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)氣養(yǎng)血，以充化腎精，有養(yǎng)血生精之功，共為臣藥。王不留行、水蛭和荔枝核共用以疏肝行氣、活血化瘀，為佐藥。全方有益腎養(yǎng)血活血之效，臨床可用于治療睪酮低下引起的男性不育癥和勃起功能障礙。

前期臨床研究[15-17]表明，養(yǎng)精膠囊可以顯著提高人體的血清睪酮水平，改善少、弱精子癥和無精子癥患者的精子數(shù)量和質(zhì)量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[18,19]表明，養(yǎng)精膠囊可促進(jìn)老年鼠睪酮的分泌，提高睪丸的臟器指數(shù)，以及精囊的分泌功能，增加精液量。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[6,7,20]結(jié)果表明，養(yǎng)精膠囊水提液可以通過提高Leydig細(xì)胞中StAR的啟動(dòng)子活性，上調(diào)其轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，提高細(xì)胞上清睪酮含量?；谇捌诘难芯炕A(chǔ)以及H19調(diào)控類固醇合成酶和睪酮生成的作用，筆者團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究養(yǎng)精膠囊對(duì)H19表達(dá)的影響，進(jìn)而探索其促進(jìn)睪酮合成的機(jī)制，具有一定的延續(xù)性和創(chuàng)新性。本研究表明，養(yǎng)精膠囊水提物可以顯著提高Leydig細(xì)胞上清中睪酮和游離睪酮的濃度，同時(shí)還可以明顯促進(jìn)LncRNA H19 mRNA以及StAR mRNA和蛋白的表達(dá)?；贖19在睪酮合成中的作用[4]，筆者團(tuán)隊(duì)初步認(rèn)為養(yǎng)精膠囊是通過H19調(diào)控StAR來促進(jìn)睪酮合成的，后期還需通過H19的干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本結(jié)果表明，補(bǔ)腎填精類中藥復(fù)方養(yǎng)精膠囊可以通過調(diào)控LncRNA H19以促進(jìn)Leydig細(xì)胞合成睪酮，這對(duì)于闡明補(bǔ)腎填精法多通路改善男性生殖功能的機(jī)制，揭示“腎藏精”的科學(xué)實(shí)質(zhì)，指導(dǎo)臨床治療睪酮降低引起的生殖疾病，提高男性的生殖健康具有重要意義。