徐小港 王鈺 徐義峰 章德林

濕疹（eczema）是一種臨床常見的炎癥性皮膚病，可侵及人體真皮淺層及表皮[1-2]，以丘疹、糜爛、滲出及瘙癢為主要癥狀，具有對稱性、反復發(fā)作性、多形損害等特點，嚴重影響患者的生活質量。本病好發(fā)于嬰幼兒和青少年，調查顯示，1～7歲兒童濕疹的粗患病率為12.94%，與早產、被動吸煙、營養(yǎng)不均衡等因素密切相關[3]。目前，西醫(yī)主要采用糖皮質激素、抗組胺藥、免疫調節(jié)劑等對癥治療，短期收效顯著，長期使用則易產生不良反應和依賴性[4]。中醫(yī)藥則通過辨病、辨證、辨體結合的診療模式，以較好的臨床療效與安全性，為本病改善癥狀、預防復發(fā)提供了有益的參考[5]。

二妙散由蒼術、黃柏組成，首載于元代旴江醫(yī)家危亦林所著的《世醫(yī)得效方》，原方名為蒼術散，后朱丹溪稱之為二妙散。其中，蒼術辛烈溫燥，可升可降，長于祛風勝濕；黃柏苦寒沉降，善清下焦?jié)駸?。二藥合用，一溫一寒，并走于下，主治濕熱流注之筋骨疼痛、下部濕瘡、腳氣赤腫等。蒼術、黃柏配伍精良，方簡效宏，是古今眾多醫(yī)家治療濕熱類疾病的核心藥組，被廣泛運用于臨床各科。姚高升[6]以二妙散為基礎方隨證加減治療濕疹，收效顯著。王振剛等[7]運用二妙散加味治療陰囊濕疹165例，總有效率達97.54%。可見，二妙散治療濕疹效果確切，但多集中于臨床研究，相關藥效成分及其作用機制尚需進一步闡明[8]。

網絡藥理學是大數據時代背景下系統(tǒng)生物學、多向藥理學、計算機軟件等相融合的新興學科，其通過可視化技術、組學方法等展示疾病-靶點-藥物的多層次網絡，尤其適合揭示中藥及復方的多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的機理[9]。本文采用生物信息學分析方法，結合分子對接技術[10]，以二妙散入血活性成分為研究對象，分析其治療濕疹的作用靶點與信號通路，進一步闡釋其臨床應用的科學內涵，為后續(xù)實驗及新藥研發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 二妙散藥物活性成分及相關靶點的篩選通過TCMSP數據庫（https://old.tcmsp-e.com/）收集并篩選二妙散中蒼術和黃柏的有效成分，設定口服生物利用度（OB）≥30%與類藥性（DL）≥0.18的2個藥物代謝動力學（ADME）屬性值為篩選條件，獲取有效入血成分及其對應的作用靶點，并利用UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）將靶點的蛋白名統(tǒng)一轉換為基因名。

1.2 濕疹相關靶點的獲取及共同靶點的Venny分析以“eczema”為關鍵詞，在GeneCards數據庫（https://www.genecards.org）和Disgenet數據庫（https://www.disgenet.org/）檢索濕疹相關靶點，運用Excel去除重復靶基因。將藥物和疾病靶點上傳至Venny作圖平臺（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html），得到疾病與藥物的共同靶點，即二妙散治療濕疹的潛在作用靶點。

1.3 二妙散“中藥-化合物-靶點-濕疹”調控網絡的構建及拓撲分析將1.2所得的潛在作用靶點在EXCEL中進行反向篩選，獲得相應的活性化合物，采用Cytoscape 3.7.1軟件構建二妙散“中藥-化合物-靶點-濕疹”網絡，并運用Cytoscape 3.7.1進行有效成分的網絡拓撲參數分析，以度（Degree）值為標準篩選出重要的成分，Degree值越大，則該節(jié)點在網絡中就越重要。

1.4 二妙散成分-濕疹靶點PPI網絡構建及拓撲分析將1.2所得的潛在作用靶點導入STRING數據庫（https://www.string-db.org/），得到蛋白互作網絡圖及蛋白質相互作用（PPI）數據，將PPI數據文件導入Cytoscape 3.7.1進行圖像優(yōu)化，并運用其中Network Analysis分析有效成分的網絡拓撲參數，以Degree值為標準篩選出重要的靶點，Degree值越大，則該節(jié)點在網絡中就越重要。

1.5 二妙散成分-濕疹功能富集分析和KEGG通路富集分析將1.2所得的潛在作用靶點導入DAVID數據庫（https://www.david.ncifcrf.gov/），“Select Identifier”設置為“OFFICIAL GENE SYMBOL”，“Select species”設置為“Homo sapiens”，設定P＜0.05，實現(xiàn)功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.6 分子對接驗證為驗證篩選出的二妙散治療濕疹潛在關鍵靶點的準確性，將1.3所得Degree值前10的核心活性成分與1.4所得的6個度值較高的靶點進行分子對接。在TCMSP數據庫下載活性成分的3D分子結構，從PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）下載靶點蛋白結構。采用PyMOL、Autoduck軟件對活性成分與靶點蛋白進行脫水（輸出pdb格式）、預處理（輸出pdbqt格式），最后進行分子對接，對接的最低標準為結合能≤-5.0 kJ/mol。對接完成后，將對接結果用熱圖展示，對接圖像運用Pymol、Discovery Studio 2016軟件進行輸出優(yōu)化。

2 結果

2.1 二妙散的活性成分及其靶點TCMSP數據庫得到蒼術、黃柏的活性成分共189個，篩選后共確定46個，去除無相關靶點的活性成分，最終保留29個活性成分，其中，蒼術4個，黃柏25個，見圖1、表1。收集活性成分相關作用靶點，其中蒼術93個，黃柏287個，去除重復靶點后，二妙散活性成分潛在作用靶點為290個。

圖1 二妙散活性成分分布圖

表1 TCMSP數據庫中保留的藥物活性成分信息表

2.2 二妙散治療濕疹的潛在作用靶點通過Disgenet、Gencards數據庫進行濕疹疾病靶點篩選，去除重復靶點，得到相關靶點3481個。運用Venny作圖平臺獲得二妙散活性成分與濕疹共同靶點（潛在作用靶點）141個，見圖2。

圖2 二妙散治療濕疹的潛在作用靶點

2.3 二妙散“中藥-化合物-靶點-濕疹”網絡構建將數據導入Cytoscape 3.7.1構建二妙散“中藥-化合物-靶點-濕疹”可視化網絡，見圖3。通過Cytoscape 3.7.1內置Network Analysis分析有效成分的網絡拓撲參數，得到度值前10的核心作用成分，見表2。結果顯示：主要的活性成分為槲皮素（MOL000098）、漢黃芩素（MOL000173）等。由圖3可知，二妙散存在一個化合物作用于多個靶點及不同化合物作用于一個靶點的情況，可見二妙散可通過多種有效成分作用于多個靶基因治療濕疹。

圖3 二妙散“中藥-化合物-靶點-濕疹”網絡圖

表2 二妙散治療濕疹核心成分信息表

2.4 二妙散治療濕疹潛在作用靶點PPI網絡構建將二妙散治療濕疹的潛在作用靶點上傳至STRING數據庫，得到PPI網絡及相關信息，并將PPI信息文件導入Cytoscape 3.7.1，得到PPI網絡圖（見圖4），通過Network Analysis分析有效成分的網絡拓撲參數，發(fā)現(xiàn)INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53等節(jié)點度值較高，提示這些靶基因在PPI網絡中較重要，其可能是二妙散發(fā)揮治療作用的關鍵靶點。

圖4 二妙散與濕疹共同基因蛋白互作網絡圖

2.5 富集分析通過DAVID數據庫對二妙散治療濕疹的潛在作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，均保留P＜0.05的結果，得到GO條目651條，包括：藥物應答（response to drug）、細胞對脂多糖的反應（cellular response to lipopolysaccharide）等生物過程（BP）條目507條；細胞外空間（extracellular space）、質膜的組成部分（integral component of plasma membrane）等細胞組成（CC）條目49條；藥物結合（drug binding）、酶結合（enzyme binding）等分子功能（MF）條目95條。對較重要條目運用Origin 2018繪制柱狀圖進行可視化，見圖5。

圖5 二妙散GO功能富集分析圖

KEGG通路富集分析顯示，濕疹可能與TNF信號通路（TNF signaling pathway）、利什曼病信號通路（Leishmaniasis）、癌癥信號通路（Pathways in cancer），Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等120條通路有關。對前20條通路運用Origin 2018進行可視化，見圖6。其中，橫坐標為通路名稱（Term）；縱坐標為Gene Ratio值，表示富集在信號通路上的靶點占該通路靶點數的比例；氣泡大小表示富集靶點數目（Count）；氣泡顏色用于表示LgP，LgP越小，代表富集程度越顯著。

圖6 二妙散KEGG通路富集分析圖

2.6 分子對接驗證為明確靶點蛋白與所對應的成分之間的結合活性，本研究選取度值前10的核心活性成分作為配體，以INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53共6個度值較高的基因作為受體，進行分子對接驗證。配體具有的潛在作用活性越強，與受體結合能量越低，對接打分則越高。分子對接所得結果顯示Docking Score均大于5，且形成范德華力、氫鍵、Pi-Sigma作用等，提示核心活性成分與靶點均具有較好的結合活性，分子對接結果見圖7，部分分子對接見圖8。

圖7 二妙散核心活性成分與關鍵靶點的分子對接打分熱圖

圖8 二妙散中活性成分與關鍵靶點的部分分子對接圖（左側為3D，右側為2D）

3 討論

濕疹是一種由內外多種因素引起的過敏性皮膚病，病因尚未明確，且發(fā)病機制復雜，導致其治療缺乏針對性和特異性。研究[11-12]表明，濕疹的發(fā)病主要與遺傳、免疫紊亂、內分泌失調及外界不良刺激等諸多因素有關。其中，由T淋巴細胞介導的細胞免疫在本病的發(fā)展中起到了重要作用，其通過分泌IL-6、IL-10等細胞因子，并與各種炎癥細胞共同作用，引起皮膚血管壁通透性增加、血管擴張而形成濕疹樣病變[13]。

中醫(yī)學認為，濕疹可緣于腠理不密，外感毒邪，雖發(fā)于表，但亦與內在臟腑功能失調有關，尤其與心火、脾濕關系甚為密切[14]。對本病的治療，歷代醫(yī)家重視從風、濕、熱論治。據報道，在治療濕疹的常用藥物中，清熱藥與利水滲濕藥占比最高，其中蒼術與黃柏均為使用頻率排名前十的中藥[15]。相關研究顯示，蒼術具有顯著的抗炎作用，可抑制TNF、IL-6、IL-8等炎性細胞因子，調節(jié)肥大細胞介導的炎癥反應，并且其化合物還具有多種抗菌活性[16-19]；黃柏可通過降低毛細血管通透性，有效緩解濕疹炎癥的滲出度，其有效成分小檗堿對濕疹的主要致病菌金黃色葡萄球菌還具有較強的抑制作用[20-21]。

網絡藥理學結果顯示，槲皮素、漢黃芩素、豆甾醇等29個成分為治療濕疹的潛在活性成分。其中，槲皮素已被證實能夠抑制組胺的釋放，有助于緩解皮膚病的過敏性炎癥[22]。研究[23]表明，漢黃芩素可通過誘導嗜酸性粒細胞凋亡，從而有效降低其數量，具有治療過敏性炎癥的作用。根據PPI分析，結合“中藥-化合物-靶點-濕疹”網絡發(fā)現(xiàn)AKT1、IL6、TNF等為關鍵靶點。AKT1是表皮末端分化的重要信號分子，可影響角質層的脆性及屏障功能，其活性的降低會引起角質形成細胞分化樣改變，導致濕疹皮炎中的角化不全[24]。研究表明，金黃色葡萄球菌感染是濕疹發(fā)病的重要原因，同時還可加重病情，在相關動物模型中IL6等促炎性細胞因子水平顯著升高[25]。TNF細胞因子的部分家族成員及其受體的表達水平與濕疹病變呈正相關，具有潛在的致病性[26]。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，二妙散調治濕疹主要涉及TNF信號通路、利什曼病信號通路、癌癥信號通路、Toll樣受體信號通路等。利什曼病是由利什曼原蟲感染所致，其可通過在細胞內誘導遲發(fā)型超敏性肉芽腫反應，加重局部組織損傷，從而引發(fā)皮膚或皮膚黏膜疾病[27]。濕疹的發(fā)病還與Toll樣受體的多態(tài)性有關，其可通過細菌定植或阻礙Th1反應/Th2轉移，誘發(fā)變態(tài)反應性疾病[28]。分子對接結果表明，槲皮素、谷甾醇、豆甾醇等活性成分與靶蛋白AKT1、IL6、TNF具有良好的對接活性，提示二妙散活性成分與靶蛋白結合穩(wěn)定，以此發(fā)揮治療濕疹的作用。

旴江醫(yī)學，名方璀璨，其中二妙散以其藥簡效宏著稱，后世多有依此化裁者，流傳古今，具有較強的生命力。本文通過網絡藥理學和分子對接技術初步分析了二妙散治療濕疹的活性成分、潛在作用靶點及生物學過程等，得出TNF信號通路、利什曼病信號通路、癌癥信號通路、Toll樣受體信號通路等可能是其治療濕疹的主要途徑。綜上，本研究可為旴江古方科學內涵的現(xiàn)代化詮釋提供參考借鑒。