袁中電 吳紅偉 沈豐 孫少華 武倫 高嘉良 劉一魁 周文波

1錦州醫(yī)科大學(xué)國藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生規(guī)培基地肝膽胰外科 ，十堰 442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)醫(yī)院肝膽胰外科，十堰 442000

B細(xì)胞異位基因(B cell translocation gene)家族，即BTG家族，作為公認(rèn)的抑癌基因，被發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)90年代，BTG2是該家族中首個(gè)被鑒定并定位的抑癌基因[1]。BTG2的N-末端結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)保守的基因系列，被命名為A盒基因序列和B盒基因序列，其中A盒具有抗增殖的作用，將細(xì)胞捕獲在G1/S期[2]，而B盒則可以與許多靶分子結(jié)合，參與細(xì)胞分裂、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信使RNA的穩(wěn)定性等過程[3-4]。BTG2在人體組織中廣泛表達(dá)，在胰腺、前列腺、肺等器官中高表達(dá)。近幾年研究證實(shí)，BTG2在肝癌[5]、前列腺癌[6]等多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，其作為一種抑癌基因在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化以及DNA損傷修復(fù)中起重要作用。但其是否參與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展鮮有報(bào)道。本研究通過檢測(cè)BTG2在胰腺癌組織中的表達(dá)情況，探討其在胰腺癌中的作用機(jī)制及臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

收集2015年6月至2020年12月間湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)總醫(yī)院病理科石蠟封存的46例胰腺癌組織、對(duì)應(yīng)的癌旁組織及肝膽胰外科9例行手術(shù)切除的新鮮胰腺癌組織、對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)，記錄患者的年齡、性別、CA19-9水平、腫瘤大小、腫瘤位置、分化程度、是否血管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。

二、胰腺癌及癌旁組織BTG2蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)石蠟封存的胰腺癌組織及癌旁組織BTG2表達(dá)情況。將46例胰腺癌組織石蠟標(biāo)本制成厚度為4 μm切片，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。兔抗人 BTG2抗體購自英國abcam公司，工作濃度1∶50，山羊抗兔IgG二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，工作濃度1∶200。由兩名病理科醫(yī)師盲法獨(dú)立閱片，胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或者褐色顆粒定為BTG2表達(dá)陽性細(xì)胞。根據(jù)BTG2染色深度及陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：無染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；陽性細(xì)胞比例<10%計(jì)1分，10%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。兩者得分相乘，積分≥4分為高表達(dá)，<4分為低表達(dá)[7]。依據(jù)BTG2表達(dá)水平，將46例胰腺癌組織及癌旁組織分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

三、胰腺癌及癌旁組織BTG2基因表達(dá)量檢測(cè)

采用熒光定量PCR法檢測(cè)9例新鮮胰腺癌組織及癌旁組織BTG2的表達(dá)量。取9例液氮凍存胰腺癌及癌旁組織，解凍后用Trizol提取組織總RNA，紫外線分光光度儀測(cè)定RNA純度及濃度。先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，熒光定量試劑盒購自英國abcam公司。BTG2正向引物序列為5′-CATCATCAGCAGGGTGGC-3′，反向引物序列為5′-CCCAATGCGGTAGGACAC-3′；內(nèi)參GADPH正向引物序列為5′-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3′，反向引物序列為5′-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3′。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。RT-PCR反應(yīng)條件： 50℃ 2 min、95℃ 2 min，95℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 59 s，40個(gè)循環(huán)。通過PCR儀器自帶軟件獲取擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值，采用公式2-ΔΔCt計(jì)算組織BTG2相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

四、隨訪

患者出院后通過來院復(fù)查隨訪或進(jìn)行電話隨訪。隨訪截至 2020年12月31日，隨訪時(shí)間為75～835 d，中位隨訪時(shí)間為387 d。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌及癌旁組織BTG2表達(dá)

BTG2蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織中均為彌散性胞質(zhì)表達(dá)(圖1)。46例胰腺癌組織中BTG2高表達(dá)29例(63.04%)，低表達(dá)17例(36.96%)；對(duì)應(yīng)癌旁組織中BTG2高表達(dá)38例(82.61%)，低表達(dá)8例(17.39%)，癌旁組織BTG2高表達(dá)率顯著高于癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.45，P=0.035)。

圖1 BTG2蛋白在胰腺癌組織(1A)和癌旁組織(1B)中的表達(dá) (免疫組織化學(xué) ×200)

9例胰腺癌組織中3例為高分化，6例為中低分化。高分化胰腺癌組織BTG2表達(dá)量顯著高于中低分化癌組織(0.66±0.07比0.24±0.18)，癌旁組織表達(dá)量顯著高于癌組織(1.00±0.00比0.38±0.30)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為5.15、-7.32，P值均<0.001)。

二、BTG2蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

46例胰腺癌組織BTG2陽性表達(dá)率與腫瘤分化程度、血管侵犯有關(guān)，而與腫瘤位置、腫瘤長徑、CA19-9水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后肝轉(zhuǎn)移無關(guān)(表1)。

表1 46例胰腺癌組織BTG2蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

三、BTG2蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

BTG2高表達(dá)組中位生存期為525 d，BTG2低表達(dá)組中位生存期為266 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖2)。死亡風(fēng)險(xiǎn)曲線圖顯示，生存<300 d患者BTG2高表達(dá)組與低表達(dá)組生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(179±69)d比(160±72)d，t=0.58，P=0.571]；生存≥300 d患者BTG2高表達(dá)組生存時(shí)間顯著長于BTG2低表達(dá)組[(616±135)d比(426±113)d]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.50，P<0.001，圖3)。單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、CA19-9水平、血管侵犯、術(shù)后肝轉(zhuǎn)移、BTG2表達(dá)水平是影響胰腺癌患者預(yù)后的因素；多因素Cox模型分析結(jié)果顯示，BTG2表達(dá)水平、血管侵犯、術(shù)后肝轉(zhuǎn)移是影響胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表2)。

圖2 BTG2蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

圖3 不同BTG2蛋白表達(dá)水平胰腺癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)曲線

表2 46例胰腺癌患者預(yù)后的單因素及多因素分析

討 論

BTG2位于1號(hào)染色體長臂的3區(qū)2帶上，共編碼158個(gè)氨基酸，最初被鑒定為p53誘導(dǎo)基因，其表達(dá)受p53依賴機(jī)制的調(diào)控[8]。此外，BTG2也可以抑制cyclin E的表達(dá)，并在無p53、Rb和cyclin D1參與下抑制細(xì)胞G1/S期的躍遷[9]。研究證實(shí)，肺癌[10]、喉癌[11]、乳腺癌[12]等多種腫瘤組織BTG2表達(dá)均明顯下調(diào)，并通過多種途徑參與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織BTG2表達(dá)陽性率及相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織，高分化胰腺癌組織表達(dá)量顯著高于中低分化組織，提示胰腺癌BTG2表達(dá)明顯下調(diào)，低表達(dá)是胰腺組織惡性表型的重要征象之一。

Devanand等[12]發(fā)現(xiàn)，BTG2可以通過抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，也可以通過表觀遺傳學(xué)沉默減緩腫瘤向周圍組織浸潤性生長，是治療堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1高表達(dá)的轉(zhuǎn)移性腫瘤的潛在靶標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，BTG2低表達(dá)與腫瘤分化程度低、血管侵犯有關(guān)，提示BTG2可能是抗衡胰腺癌侵襲性的潛在靶點(diǎn)，與BTG2在骨肉瘤[13]、宮頸癌[14]的相關(guān)研究結(jié)果一致。

Zubair等[11]報(bào)道，實(shí)體腫瘤中BTG1或BTG2的表達(dá)降低通常與惡性細(xì)胞行為和不良治療結(jié)果相關(guān)，其基因產(chǎn)物的表達(dá)情況可作為疾病進(jìn)展的生物標(biāo)記。文獻(xiàn)報(bào)道，BTG2蛋白的表達(dá)水平可作為多種癌癥的預(yù)后生物標(biāo)志物，比如三陰性乳腺癌[15-16]、喉癌[17]、肝癌[18]。Wang等[19]報(bào)道，BTG2表達(dá)水平是影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，BTG2的下調(diào)可用作鑒定和預(yù)測(cè)食管癌進(jìn)展和放射敏感性的分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，BTG2高表達(dá)組中位生存期顯著長于BTG2低表達(dá)組，提示BTG2高表達(dá)能顯著改善患者預(yù)后，術(shù)后300 d后BTG2低表達(dá)組患者死亡風(fēng)險(xiǎn)隨生存時(shí)間延長顯著高于高表達(dá)組，說明BTG2對(duì)胰腺癌預(yù)后的影響主要發(fā)生在遠(yuǎn)期。單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、CA19-9水平、血管侵犯、術(shù)后肝轉(zhuǎn)移以及BTG2表達(dá)水平均與預(yù)后有關(guān)。多因素分析結(jié)果顯示，血管侵犯、術(shù)后肝轉(zhuǎn)移、BTG2表達(dá)水平為影響胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，即BTG2低表達(dá)提示預(yù)后較差。

綜上所述，BTG2在胰腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)，BTG2表達(dá)水平是影響胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其影響主要發(fā)生在遠(yuǎn)期。但本研究納入BTG2定量分析例數(shù)較少，且缺乏表觀遺傳學(xué)研究，尚需大樣本以及納入更多因素的研究予以進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明袁中電：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、論文撰寫；吳紅偉、孫少華、沈豐：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；高嘉良、劉一魁：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；周文波、武倫：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持