孫銘悅 雷珂 任琳琳 王佳 鞏芮寧 田字彬

1青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，青島 266042；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤免疫及細胞治療中心，青島 266042

【提要】 采用RT-PCR法檢測RNA結(jié)合蛋白核不均一核糖核蛋白(HNRNP)AB的兩個剪接體HNRNPAB1和HNRNPAB2在15株惡性腫瘤細胞系、1株正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞系、4株胰腺癌細胞系及17例胰腺腫瘤組織中的表達。結(jié)果顯示胰腺癌細胞系以HNRNPAB2表達為主，而肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、宮頸癌、視網(wǎng)膜惡性腫瘤、乳腺癌細胞系等腫瘤細胞系以HNRNPAB1表達為主。正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞的HNRNPAB1與HNRNPAB2表達量顯著低于胰腺癌細胞系。HNRNPAB1與HNRNPAB2的表達量比值與胰腺癌惡性程度呈正相關(guān)。

剪接是將內(nèi)含子從前體mRNA中移除，外顯子連接形成成熟mRNA的過程。可變剪切(alternative splicing，AS)又稱選擇性剪切，在前體mRNA到成熟RNA的過程中，不同的剪切方式使得同一個基因可以產(chǎn)生多個不同的成熟mRNA，最終產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。近年來研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，AS事件在肺癌、膀胱癌和乳腺癌等癌癥中廣泛存在,且在急性髓系白血病、慢性淋巴細胞白血病和黑色素瘤中高度復(fù)發(fā)。剪接因子通常以濃度依賴的方式引起選擇性剪接的變化，并通過影響多種細胞過程的全基因組剪接改變促進致癌轉(zhuǎn)化。

核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleo-protein, HNRNPs)是一個龐大的、結(jié)構(gòu)多樣的RNA結(jié)合蛋白家族，在剪接、mRNA運輸和翻譯中具有不同的作用[3]。HNRNPAB作為家族成員之一，位于真核細胞的細胞核中，可協(xié)助前體mRNA的可變剪接[4]，參與聚腺苷酸化[5]、mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控、核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)運和DNA復(fù)制與重組[6]，還參與癌癥發(fā)生發(fā)展，促進腫瘤細胞的形成、侵襲、轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后。HNRNPAB剪切體有兩種，兩種剪切體協(xié)同作用，才能促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)細胞的正常遷移[7]。有研究報道[8]，AS事件風(fēng)險值可作為胰腺癌的獨立預(yù)后因子。本研究檢測HNRNPAB兩種剪切體在胰腺癌細胞系和腫瘤組織中的表達差異，探討其臨床意義，以期能為胰腺癌的診治提供新的分子標(biāo)志物和治療靶點。

一、材料與方法

1．胰腺癌組織及細胞株：收集2019年4月至2020年2月間青島大學(xué)附屬醫(yī)院儲存在-80℃冰箱中的RNAlater(美國Sigma公司)中的17例胰腺腫瘤組織及肝轉(zhuǎn)移組織，其中良性腫瘤6例，分別為胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤2例，胰腺實性假乳頭狀瘤2例，微囊性腺瘤1、黏液性囊性腫瘤1例。惡性腫瘤11例，均為胰腺導(dǎo)管腺癌，其中6例無淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移，定義為低度惡性；5例有淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移，定義為高度惡性。記錄患者年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、臨床分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移等。

共選擇20株細胞系。人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞系HPDE6-C7及胰腺癌細胞系A(chǔ)SPC1、BXPC-3、PANC1、MIA PaCa-2均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；肝癌細胞系HccL-M3、HepG2、Hep3β、HuH7、PLC，結(jié)腸癌細胞系HT-29、SW480，胃癌細胞系A(chǔ)GS、BCG832，宮頸癌細胞系Hela、Siha、C33A，視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞系Y79、OCM-1，乳腺癌細胞系HCC1937均為青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心惠贈。所有細胞株均常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。

2．RT-PCR擴增HNRNPAB剪切體：采用Trizol(美國Invitrogen公司)分別抽提20株對數(shù)生長期細胞及17例胰腺腫瘤組織總RNA，使用Biospec Nano核酸分析儀(Shimadzu Spectrophotometer)檢測樣本RNA純度和濃度。采用PrimeScriptRT reagent Kit gDNA Eraser試劑盒(日本TaKaRa公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按說明書操作。利用NCBI網(wǎng)站設(shè)計能同時擴增HNRNPAB剪切體1和2的特異性引物，正向引物序列為5′-GGCTACGGCAACTACTGGAA-3′，反向引物序列為5′-GCATGTGTGCGATCAGTTGG-3′。引物由北京六合華大基因科技有限公司青島分公司合成。應(yīng)用Phanta Master Mix(南京Vazyme公司)行PCR擴增，反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，通過ImageJ圖像分析軟件行灰度掃描，以條帶灰度值代表其表達量。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，取均值。

3．測序：將擴增的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司青島分公司測序，測序結(jié)果與原始序列進行對比，確定PCR擴增片段是否為目標(biāo)剪切體序列。

二、結(jié)果

1．HNRNPAB兩種剪切體的測序鑒定：胰腺腫瘤組織及細胞RNA均擴增出2條片段，分子質(zhì)量分別為352、211 bp，條帶大小與預(yù)期產(chǎn)物片段大小相一致。分離、純化凝膠電泳中所見的2條帶的PCR產(chǎn)物，測序結(jié)果證實其核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中HNRNPAB基因2種剪切體序列信息完全一致。HNRNPAB1的產(chǎn)物為352 bp，HNRNPAB2的產(chǎn)物為211 bp。

2．各細胞系HNRNPAB兩種剪切體的表達：1株人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞系HPDE6-C7、4株胰腺癌細胞系A(chǔ)SPC1、BXPC-3、PANC1、MIA PaCa-2細胞HNRNPAB兩種剪切體表達的灰度值及HNRNPAB1/HNRNPAB2灰度值比(AB1/AB2值)見表1。4株胰腺癌細胞系的HNRNPAB1表達量均顯著低于HNRNPAB2，均以HNRNPAB2表達為主。HNRNPAB1平均灰度值為6286.06，HNRNPAB2為9446.60，平均AB1/AB2值為0.67，均顯著高于HPDE6-C7細胞的1 457±178、2 719±176、0.54，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)，提示胰腺癌細胞株HNRNPAB均高表達，且以HNRNPAB2表達為主。

表1 胰腺細胞株HNRNPAB剪切體灰度值

肝癌、腸癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤共15株細胞系HNRNPAB1的表達量均顯著高于HNRNPAB2(表2)，均以HNRNPAB1表達為主，HNRNPAB1平均灰度值為10011.00，HNRNPAB2為5839.37，平均AB1/AB2值為1.79。其他惡性腫瘤細胞株的平均AB1/AB2值顯著高于胰腺癌細胞株的平均AB1/AB2值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.79比0.67，t=6.13，P<0.010)。

表2 15株其他惡性腫瘤細胞系HNRNPAB剪切體灰度值

3．胰腺腫瘤組織HNRNPAB兩種剪切體的表達：17例胰腺腫瘤組織HNRNPAB1、HNRNPAB2剪切體電泳圖見圖1。6例胰腺良性腫瘤均以HNRNPAB2表達為主，HNRNPAB1平均灰度值為2 981，HNRNPAB2為6 137，平均AB1/AB2值為0.35(表3)。6例為低度惡性胰腺癌中，HNRNPAB2的灰度值均顯著高于HNRNPAB1，以HNRNPAB2表達為主。HNRNPAB1平均灰度值為2 412，HNRNPAB2為5 575，平均AB1/AB2值為0.41(表4)。5例高度惡性胰腺癌組織中，3例HNRNPAB2的灰度值略高于HNRNPAB1，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，以HNRNPAB2表達為主；1例導(dǎo)管腺癌伴腹腔轉(zhuǎn)移灶組織及1例神經(jīng)內(nèi)分泌癌伴肝轉(zhuǎn)移組織HNRNPAB2灰度值低于HNRNPAB1(P值分別為0.001、0.432，表4)。HNRNPAB1平均灰度值為9 444，HNRNPAB2為9 535，平均AB1/AB2值為1.10。高度惡性腫瘤的AB1/AB2顯著高于低度惡性腫瘤及良性腫瘤，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為3.05、2.95，P值分別為0.013、0.016)，而低度惡性腫瘤與良性腫瘤的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

注：1、2、3、5、7、8、9、10、12、13、15為胰腺癌；4、6為胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤；11為微囊性腺瘤；14、16為胰腺實性假乳頭狀瘤；17為黏液性囊性瘤圖1 17例胰腺腫瘤組織HNRNPAB1、HNRNPAB2剪切體電泳圖

表3 6例胰腺良性腫瘤組織HNRNPAB剪切體灰度值

表4 11例胰腺癌組織HNRNPAB剪切體灰度值

4．胰腺癌組織HNRNPAB兩種剪切體表達量比值與腫瘤臨床病理參數(shù)的相關(guān)性：以11例胰腺癌組織AB1/AB2中位數(shù)為界，將其分為AB1/AB2<0.7組和≥0.7組，結(jié)果顯示，兩組的差異與臨床分期顯著相關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤病理分級、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(表5)。

表5 胰腺癌組織HNRNPAB兩種剪切體灰度值比與腫瘤臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

討論HNRNPAB蛋白結(jié)構(gòu)上含有兩個串聯(lián)的RNA結(jié)合域(RNA Binding Domain，RBD)以及保守的N端和C端的結(jié)構(gòu)域，C末端的結(jié)構(gòu)域富含甘氨酸，一般稱為輔助結(jié)構(gòu)域，負責(zé)與其他HNRNPs相互作用[9-10]。RNA結(jié)合的特異性主要是由蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)介導(dǎo)，RBD周圍的結(jié)構(gòu)區(qū)域微調(diào)RNA與蛋白質(zhì)的相互作用[11]。HNRNPAB1含有8個外顯子，編碼322個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量約為36 000；HNRNPAB2的輔助結(jié)構(gòu)域缺少1個約140 bp外顯子，編碼285個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量約為30 000。輔助結(jié)構(gòu)域的不同，可能影響其功能。

文獻報道，肝癌[12]、前列腺癌[13]、纖維母細胞瘤[14]組織HNRNPAB總量呈高表達。肝癌組織HNRNPAB可通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition, EMT)促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移[12]；HNRNPAB可激活與前列腺癌進展相關(guān)的細胞周期基因子集，從而促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[13]；腫瘤纖維母細胞組織HNRNPAB作為一種TGF-β誘導(dǎo)因子可導(dǎo)致腫瘤形成及惡化[14]；乳腺癌HNRNPAB表達參與細胞周期調(diào)控，特別是G2/M期的轉(zhuǎn)變影響預(yù)后[15]。上述研究表明HNRNPAB在腫瘤的發(fā)生中可能是一種促癌因素，但這些研究主要關(guān)注的是HNRNPAB的功能，而沒有涉及到HNRNPAB兩個剪切體。

本研究結(jié)果顯示，4株胰腺癌細胞株HNRNPAB1及HNRNPAB2表達均顯著高于正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞系，且以HNRNPAB2表達為主，提示胰腺惡性細胞株HNRNPAB高表達，尤其是HNRNPAB2表達量更高。但其他組織來源的腫瘤細胞系絕大多數(shù)HNRNPAB高表達，以HNRNPAB1表達為主。其原因可能是HNRNPAB兩種剪切體的主要功能域雖然相同，但輔助結(jié)構(gòu)域不同，后者負責(zé)與其他HNRNPs進行相互作用[9-10]，提示HNRNPAB兩種剪切體可能與不同HNRNPs結(jié)合而發(fā)揮不同的功能，形成不同的功能模塊及蛋白網(wǎng)絡(luò)。因此在胰腺組織中的RNA結(jié)合蛋白HNRNPAB，可能以HNRNPAB2剪切體的蛋白作用網(wǎng)絡(luò)為主，通過其mRNA選擇性剪切以及蛋白互相作用的功能，在胰腺發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果還顯示，胰腺癌組織HNRNPAB兩個剪切體表達量升高，絕大多數(shù)以HNRNPAB2表達為主。高度惡性腫瘤的AB1/AB2值顯著高于低度惡性腫瘤及良性腫瘤，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而低度惡性腫瘤與良性腫瘤的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。胰腺癌肝轉(zhuǎn)移組織及腹腔轉(zhuǎn)移灶組織主要表達HNRNPAB1，提示隨著胰腺癌惡性程度的增高，HNRNPAB1的表達水平迅速增高，甚至超越HNRNPAB2。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移的胰腺癌AB1/AB2≥0.7與腫瘤臨床Ⅲ+Ⅳ分期呈正相關(guān)也支持HNRNPAB1高表達促進腫瘤的遷移和侵襲這一結(jié)論。

本研究尚存在一些缺陷：其一，缺少對其他腫瘤細胞株相應(yīng)的正常細胞株的檢測；其二，沒有匹配胰腺癌旁正常胰腺組織檢測；其三，病例數(shù)少，故需更多的嚴謹?shù)难芯吭O(shè)計和更多的臨床樣本進行驗證。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突