宋劍鋒，白明輝，劉少朋

(1.前海人壽廣州總醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州 511300；2.鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院 肝膽外科，河南 洛陽 471000)

近年來，分子靶向治療在胰腺癌中的應(yīng)用是一個研究熱點[1]，但腫瘤耐藥仍是影響其治療效果的重要因素之一。血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)可表達于腫瘤組織和正常組織[2-3]，研究表明，VEGFA在胰腺癌中異常高表達，且可通過MAPK/ERK信號通路調(diào)控胰腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移[4-5]。miR-122-3p是miR-122家族成員之一[6]，且在胃癌、肺癌等多種腫瘤中呈低表達[7-8]。本研究團隊前期通過生物學預測軟件發(fā)現(xiàn)VEGFA基因可能是miR-122-3p潛在的靶基因之一。因此，本研究提出miR-122-3p靶向調(diào)控VEGFA基因可能參與胰腺癌進展的假設(shè)，進一步探究其分子作用機制，以期為胰腺癌的分子靶向治療提供新的生物學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料各實驗細胞株均購自中科院上海細胞庫，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)液、胰酶購自賽默飛世爾科技中國有限公司，Trizol RNA提取試劑盒、定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcriptase-mediated polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒(QP115)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自艾美捷科技有限公司，LipofectamineTM2000購自北京索萊寶科技有限公司。熒光定量PCR引物：β-actin上游引物為5’-TACCTCCCAAGTCCTGTATGAG-3’，下游引物為5’-TGAGCAGCATCAAACTGTGTAG-3’；miR-122-3p上游引物為5’-AACAGCACAAACUACUACCUCA-3’，下游引物為5’-UAUUUAGUGUGAUAAUGGCGUU-3’；VEGFA上游引物為5’-ATGCCGGTTCCAACCAGAA-3’，下游引物為5’-GTGGAGGAGCGAGCTGAA-3’。miR-122-3p、miR-con、pcDNA、pcDNA-VEGFA、突變型VEGFA(mutant type VEGFA，MUT-VEGFA)、野生型VEGFA(wild type VEGFA，WT-VEGFA)的構(gòu)建及測序由蘇州態(tài)和生物科技有限公司提供。兔抗人基質(zhì)金屬肽酶-2(matrix metallopeptidase-2，MMP-2)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1(extracellular regulated protein kinase 1，ERK1)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗購于上海普邁生物科技有限公司，自動酶標儀購自上海寰熙醫(yī)療器械有限公司(型號SM800)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(型號RG027)，吉姆薩染色液購自達科為生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染與分組將miR-122-3p相對表達量最低的AsPC-1細胞接種于6板孔，至細胞融合度達70%～80%，按照LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染，qRT-PCR法測定轉(zhuǎn)染效率。實驗分組如下：NC組(細胞不作處理)、miR-con組(轉(zhuǎn)染對照miR-con)、miR-122-3p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-122-3p模擬物)、miR-122-3p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-122-3p和空載體pcDNA)和miR-122-3p+pcDNA-VEGFA組(共轉(zhuǎn)染miR-122-3p和pcDNA-VEGFA)。

1.3 qRT-PCR采用Trizol法分別提取各組細胞總RNA，測定其濃度及純度，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并行PCR擴增，Bio-Rad CFX96 PCR儀測定miR-122-3p、VEGFA及β-actinmRNA表達水平。設(shè)置5個復孔。相對表達量以2-ΔΔCT表示，其中ΔCT為miR-122-3p或VEGFA CT值與β-actin CT值的差值。

1.4 MTT法將各組細胞分別接種于24孔板(5×104個·mL-1)，并分別培養(yǎng)24、48、72 h，棄去上清液后加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液(每孔200 μL)，并加入MTT液(每孔20 μL)，避光培養(yǎng)6 h，加入二甲基亞砜(每孔100 μL)，震蕩15 min。待結(jié)晶溶解后使用自動酶標儀測定每孔490 nm處吸光度(A490)，并繪制細胞生長曲線。

1.5 平板克隆實驗將各組細胞分別接種于6孔板并進行培養(yǎng)，采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗后加入40 g·L-1多聚甲醛(每孔1 mL)，固定20 min后用1 g·L-1結(jié)晶紫染液染色15 min，漂洗并晾干。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)細胞，Image J軟件統(tǒng)計細胞克隆數(shù)。

1.6 細胞劃痕實驗將各組細胞分別接種于細胞培養(yǎng)板并進行培養(yǎng)(含體積分數(shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱)，用20 μL槍頭垂直劃過細胞，48 h后拍照，Image J軟件測定細胞劃痕愈合情況，計算細胞遷移能力。

1.7 Transwell實驗Matrigel膠預處理Transwell小室，胰酶消化各組細胞后進行細胞重懸，上部加入20 μL細胞懸液，下部加入60 μL胎牛血清培養(yǎng)基(體積分數(shù)為30%)，培養(yǎng)24 h后以PBS沖洗3次，40 g·L-1多聚甲醛固定后用吉姆薩染色液染色，顯微鏡下計數(shù)細胞。

1.8 蛋白質(zhì)印跡實驗分別提取各組細胞總蛋白并調(diào)整濃度，行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，Western封閉液封閉2 h，PBS清洗3次，分別加入相應(yīng)一抗，4 ℃下孵育過夜，PBS再次沖洗后加入羊抗兔IgG二抗，37 ℃下孵育2 h，電化學發(fā)光液顯影后于暗室拍照。Bandscan 5.0軟件行灰度分析，設(shè)目的蛋白相對表達量為目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值。

1.9 雙熒光素酶報告基因法分別構(gòu)建WT-VEGFA及MUT-VEGFA的3’UTR熒光素酶基因載體，采用LipofectamineTM2000將miR-122-3p minic和對照miR-con分別與MUT-EVEGFA及WT-VEGFA共轉(zhuǎn)染AsPC-1細胞，培養(yǎng)48 h后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組AsPC-1細胞熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-122-3p及VEGFA表達miR-122-3pmRNA在胰腺癌細胞株BxPC-3、Capan-1、PANC-1、HPAC、AsPC-1中相對表達量分別為0.64±0.02、0.63±0.07、0.59±0.04、0.60±0.01、0.47±0.13，均低于HPDE細胞株(2.02±0.06)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VEGFAmRNA在上述胰腺癌細胞中相對表達量分別為5.23±0.19、5.34±0.02、5.30±0.14、5.27±0.27、5.54±0.15，均高于HPDE株細胞(1.09±0.26)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染效率測定miR-122-3p mimic組AsPC-1細胞中miR-122-3p相對表達量(3.49±0.18)高于NC組(0.52±0.21)及miR-con組(0.55±0.13)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-122-3p+pcDNA-VEGFA組AsPC-1細胞中VEGFA相對表達量(10.44±0.51)高于NC組(1.09±0.23)及miR-122-3p+pcDNA組(1.07±0.17)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。見圖2。

*P<0.05。

★P<0.05。

2.3 過表達miR-122-3p抑制胰腺癌細胞增殖及克隆形成不同時間點(24、48、72 h)miR-122-3p mimic組AsPC-1細胞活力分別為1.35±0.16、2.78±0.44、3.40±0.71，分別低于NC組的2.02±0.25、5.44±0.18、7.54±0.33及miR-con組的2.00±0.19、5.38±0.11、7.47±0.50，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，NC組與miR-con組細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。miR-122-3p mimic組細胞克隆數(shù)為20.33±3.31，低于NC組(78.11±8.20)及miR-con組(76.49±7.91)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖3 過表達miR-122-3p對胰腺癌AsPC-1細胞增殖的影響

*P<0.05。

2.4 過表達miR-122-3p抑制肝癌細胞遷移及侵襲miR-122-3p mimic組細胞遷移率低于NC組(t=-13.121，P<0.001)及miR-con組(t=-12.242，P<0.001)，見表1。miR-122-3p mimic組遷移相關(guān)蛋白MMP-2相對表達量低于NC組(t=-7.599，P<0.001)及miR-con組(t=-19.785，P<0.001)，見表1和圖5。miR-122-3p mimic組穿膜細胞數(shù)低于NC組(t=-41.716，P<0.001)及miR-con組(t=-51.817，P<0.001)，見表1和圖6。

表1 轉(zhuǎn)染后不同組別細胞遷移率、MMP-2相對表達量及穿膜細胞數(shù)比較

*P<0.05。

圖6 過表達miR-122-3p抑制AsPC-1細胞侵襲

2.5 miR-122-3p靶向調(diào)控VEGFA表達miR-122-3p與WT-VEGFA共轉(zhuǎn)染AsPC-1細胞后，miR-122-3p mimic組細胞熒光素酶活性低于NC組及miR-con組(0.51±0.13比2.11±0.24、2.08±0.46；t1=-17.552，P1<0.05；t2=-9.279，P2<0.05)；與MUT-VEGFA共轉(zhuǎn)染后，miR-122-3p mimic組與NC組及miR-con組細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(1.10±0.22比1.12±0.20、1.09±0.89；t1=-1.243，P1>0.05；t2=-1.936，P2>0.05)。

2.6 過表達VEGFA可逆轉(zhuǎn)miR-122-3p對胰腺癌細胞惡性生物學行為的抑制作用miR-122-3p+pcDNA-VEGFA組AsPC-1細胞在不同時間點細胞活力均高于miR-122-3p+pcDNA組，細胞遷移率、穿膜細胞數(shù)均高于miR-122-3p+pcDNA組[細胞遷移率(11.20±1.93)%比(2.35±0.53)%，t=10.609，P<0.001；穿模細胞數(shù)(84.39±2.92)個比(22.15±2.50)個，t=49.435，P<0.001]，見圖7A、7B、7C。細胞內(nèi)MMP-2、VEGFA、ERK1、MAPK蛋白表達水平增高，miR-122-3p mimic組細胞內(nèi)上述蛋白表達低于miR-con組(P<0.001)，見圖8A、8B。

A為AsPC-1細胞活力；B為AsPC-1細胞遷移率；C為AsPC-1穿膜細胞數(shù)；*P<0.05。

A為電泳條帶圖；B為條形圖；*P<0.05。

3 討論

miRNA是一類高度保守的非編碼小RNA，由20～24 nt組成，廣泛存在于真核細胞中[9-10]。作為一種重要的調(diào)控因子，miRNA廣泛參與多種腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的生物學作用[11-12]，因此受到研究者的廣泛關(guān)注。研究顯示，miR-122-3p參與多種疾病的進展，如Zhao等[13]研究顯示miR-122-3p參與股骨頭壞死的發(fā)展進程，Wang等[14]研究顯示miR-122-3p可通過靶向A549抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡，Yang等[15]研究顯示miR-122-3p可作為藥物性肝損傷潛在的毒理學生物標志物，但目前關(guān)于miR-122-3p在胰腺癌中作用的相關(guān)研究仍較少。

本研究結(jié)果顯示，miR-122-3p在胰腺癌細胞BxPC-3、Capan-1、PANC-1、HPAC、AsPC-1中表達下調(diào)，VEGFA表達上調(diào)，初步表明miR-122-3p在胰腺癌中存在差異表達。進一步構(gòu)建過表達miR-122-3p的胰腺癌AsPC-1細胞，檢測結(jié)果顯示miR-122-3p mimic組細胞增殖、克隆及遷移、侵襲能力均低于NC組及miR-con組，同時MMP-2表達水平也降低，提示過表達miR-122-3p會抑制胰腺癌細胞的惡性生物學行為，并可抑制參與腫瘤進展的MMP-2蛋白的表達。雙熒光素酶報告基因檢測和蛋白質(zhì)印跡實驗顯示，VEGFA與miR-122-3p存在靶向作用關(guān)系。為進一步驗證此結(jié)果，本研究構(gòu)建過表達VEGFA的miR-122-3p+pcDNA-VEGFA組細胞，細胞實驗結(jié)果顯示miR-122-3p+pcDNA-VEGFA組AsPC-1細胞增殖、克隆、遷移及侵襲等惡性生物學行為均高于miR-122-3p+pcDNA組，這表明過表達VEGFA可逆轉(zhuǎn)miR-122-3p對胰腺癌惡性生物學行為的抑制作用。蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示，miR-122-3p+pcDNA-VEGFA組細胞內(nèi)MMP-2、VEGFA、ERK1、MAPK蛋白表達水平增高，miR-122-3p mimic組細胞內(nèi)上述蛋白表達水平降低。MMP-2、VEGFA、ERK1、MAPK均是MAPK/ERK信號通路中的重要蛋白，參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展進程[16-19]。因此，結(jié)合上述研究結(jié)果，推測miR-122-3p靶向VEGFA抑制胰腺癌細胞的惡行生物學行為可能與抑制MAPK/ERK信號通路的活化有關(guān)，但其需要進一步深入研究證實。

綜上所述，本研究初步表明miR-122-3p在胰腺癌細胞中低表達，過表達miR-122-3p可抑制胰腺癌細胞的惡性生物學行為，作用機制可能與靶向VEGFA有關(guān)，這為尋求胰腺癌新的分子靶點提供了一定參考。