張娟娟，楊菊芬，李雪飛，楊 曼

(河南省直第三人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科， 河南 鄭州 450000)

周圍神經(jīng)損傷是手足外科常見疾病，坐骨神經(jīng)損傷是其主要類型，可導(dǎo)致感覺障礙、肌肉萎縮、運(yùn)動(dòng)能力降低[1]。近年來，坐骨神經(jīng)損傷發(fā)病率不斷升高，年確診人數(shù)超百萬，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量[2]。臨床治療坐骨神經(jīng)損傷通常采用糖皮質(zhì)激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子、免疫抑制劑等藥物治療及顯微外科修復(fù)術(shù)等方式,但藥物治療周期長(zhǎng)、療效存在較大的提升空間；手術(shù)雖可精準(zhǔn)解除卡壓而為周圍神經(jīng)再生創(chuàng)造有利條件，但鑒于神經(jīng)再生速度慢、肌肉萎縮、周圍組織水腫粘連等因素神經(jīng)再生的效果并不理想[3]。因此，探索促進(jìn)神經(jīng)再生、促進(jìn)肢體運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)的高效的治療手段對(duì)坐骨神經(jīng)損傷的治療意義重大。穴位針刺是中醫(yī)常用治療方式，是用針灸針刺入人體的特定穴位，使能量進(jìn)入或離開從而使陰陽恢復(fù)平衡。目前穴位針刺與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療周圍神經(jīng)損傷的臨床療效已被證實(shí)，但其對(duì)周圍神經(jīng)再生的作用機(jī)制尚不清楚[4]。本研究通過建立受壓坐骨神經(jīng)大鼠模型，研究電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)受壓坐骨神經(jīng)再生及肢體運(yùn)動(dòng)功能的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)雄性SD大鼠45只，6周齡，體質(zhì)量(200±10)g，購自上海靈暢生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(滬)2018-0003，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為2020A054，在河南中檢檢測(cè)技術(shù)有限公司飼養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用許可證編號(hào)為SYXK(豫)2018-0006。

1.2 藥品、試劑與儀器

LY294002，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路阻斷劑，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)154447-36-6；兔抗大鼠Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、mTOR、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)一抗,均為美國Abcam公司產(chǎn)品，批號(hào)依次為ab8805、ab8933、ab134903、ab109268。6805-C電針儀，上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；IX-400型多導(dǎo)生理記錄儀，美國iWorx公司產(chǎn)品；DM750光學(xué)顯微鏡，德國徠卡公司產(chǎn)品；DYY-8C型電泳儀、WD-9413A型凝膠成像分析系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與模型的建立

在45只大鼠中隨機(jī)選擇10只設(shè)為假手術(shù)組，剩余大鼠按照參考文獻(xiàn)[5]方法制備受壓坐骨神經(jīng)模型。俯臥位手術(shù)臺(tái)固定，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，右側(cè)臀線處備皮消毒，剪開皮膚，切口長(zhǎng)約20 mm，鈍性分離皮下，暴露梨狀肌和坐骨神經(jīng)，止血鉗夾持梨狀肌下方5 mm處5 s，松開，縫合傷口。假手術(shù)組大鼠僅暴露梨狀肌和坐骨神經(jīng)，縫合傷口。術(shù)后每天觀察大鼠一般情況，出現(xiàn)左后肢跛行、蜷縮表示造模成功。共有32只大鼠成功建立受壓坐骨神經(jīng)模型，將其隨機(jī)分為模型組(11只)、電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(11只)、電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+LY294002組(10只)。

1.4 治療方法

自模型建立成功第7天開始干預(yù)。電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組：根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]選取大鼠左側(cè)環(huán)跳穴(髖關(guān)節(jié)后上部)、陽陵泉穴(腓骨小頭前下緣)、殷門穴(后肢上部中心)、承山穴(后肢腓腸肌凹陷點(diǎn))，將電針儀電針正極接于環(huán)跳、陽陵泉穴，對(duì)應(yīng)負(fù)極接于陽陵泉、承山穴，以頻率200 Hz、電流強(qiáng)度2 mA進(jìn)行電針治療，每日15 min，持續(xù)10 d；此外，將大鼠置于DB-YLS-15A型小動(dòng)物轉(zhuǎn)輪式跑步機(jī)(北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品)上，以5轉(zhuǎn)/min進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，每日5 min，持續(xù)10 d。電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+LY294002組在電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組治療基礎(chǔ)上皮下注射LY294002 4 μg/g[7]；假手術(shù)組、模型組和電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組尾靜脈注射1 mL生理鹽水，均為干預(yù)第1天一次性用藥。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

治療結(jié)束1 d后進(jìn)行斜板實(shí)驗(yàn)與坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測(cè)；然后，各組大鼠禁食禁水6 h，腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉，脫頸處死；摘取左右兩側(cè)完整腓腸肌及左側(cè)坐骨神經(jīng)；將坐骨神經(jīng)組織分為3份，2份以40 g/ L多聚甲醛固定，用于免疫組化染色及蘇木精-伊紅(HE)染色，1份投入液氮中，用于蛋白檢測(cè)。

1.5.1 運(yùn)動(dòng)功能

采用斜板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)功能[8]，于干預(yù)1 d后進(jìn)行。將兩塊矩形合金板用鉸鏈連接，分別作為底板和旋轉(zhuǎn)板，下方放置橡膠墊緩震。將大鼠頭向前垂直放置于水平旋轉(zhuǎn)板中央位置，緩慢旋轉(zhuǎn)鉸鏈?zhǔn)沟装迮c旋轉(zhuǎn)板角度增大，從0°起逐次增加5°，記錄每只大鼠停留5 s不跌落的最大角度，測(cè)試3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)前10 min將大鼠帶入實(shí)驗(yàn)房間適應(yīng)環(huán)境，保持房間安靜。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后擦拭板體以防影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度

采用神經(jīng)電生理檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)，按1.3項(xiàng)下操作，暴露坐骨神經(jīng)，將多導(dǎo)生理記錄儀刺激、記錄電極分別接于坐骨神經(jīng)近心、遠(yuǎn)心端，設(shè)置采集頻率100 kHz，靈敏度4 mV，時(shí)間常數(shù)0.2 s，刺激電壓1 V，波寬0.1 ms。坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度=刺激電極與記錄電極的距離/潛伏期時(shí)間[9]。測(cè)試3次，取平均值。

1.5.3 腓腸肌恢復(fù)率

取大鼠左右兩側(cè)完整腓腸肌，分別測(cè)量濕重，計(jì)算腓腸肌恢復(fù)率。腓腸肌恢復(fù)率(%)=左側(cè)腓腸肌濕重(g)/右側(cè)腓腸肌濕重(g)×100%

1.5.4 坐骨神經(jīng)微血管密度(MVD)

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)坐骨神經(jīng)MVD。取40 g/L多聚甲醛固定的坐骨神經(jīng)組織，梯度蔗糖脫水，聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物包埋，12 μm厚度冰凍切片，CD34免疫組織化學(xué)染色。顯微鏡下觀察神經(jīng)微血管密度，以單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或棕色內(nèi)皮細(xì)胞群為一個(gè)血管，200倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)血管密集區(qū)視野，記錄血管數(shù)量，求平均值。

1.5.5 坐骨神經(jīng)的組織病理學(xué)觀察

取40 g/L多聚甲醛固定的坐骨神經(jīng)組織，流水沖洗25 min，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，冷卻，4 μm厚度切片，常規(guī)脫蠟，酒精水化，HE染色，滴入封片劑封片，顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)的組織病理學(xué)形態(tài)。

1.5.6 坐骨神經(jīng)組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)

采用Western blot法檢測(cè)。取液氮保存的坐骨神經(jīng)組織，用研磨器研磨，PBS洗滌勻漿，注入離心管；加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上8 500 r/min離心(離心半徑10 cm)15 min，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒定量蛋白；取40 μg樣品與上樣緩沖液按體積比1∶5混合，沸水浴加熱5 min，離心取上清，電壓80 V行上樣電泳分離；電壓110 V濕轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，搖床清洗、體積分?jǐn)?shù)50 mL/L脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜；加入兔抗大鼠Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，常溫孵育2 h，TBST洗膜；加入ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光，經(jīng)一體式凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，分析灰度值。以Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白/內(nèi)參GAPDH灰度值表示Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)最大角度減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)最大角度增加(P<0.05)。與電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+LY294002組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)最大角度減少(P<0.05)。結(jié)果表明，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可改善運(yùn)動(dòng)功能，而LY294002可減弱其作用。見表1。

表1 各組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)最大角度對(duì)比

2.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度升高(P<0.05)。與電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+LY294002組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低(P<0.05)。結(jié)果表明，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可改善周圍神經(jīng)傳導(dǎo)能力，而LY294002可減弱其作用。見表2。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度對(duì)比

2.3 各組大鼠腓腸肌恢復(fù)率對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組腓腸肌恢復(fù)率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組腓腸肌恢復(fù)率升高(P<0.05)。與電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+LY294002組腓腸肌恢復(fù)率降低(P<0.05)。結(jié)果表明，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可改善大鼠神經(jīng)功能，而LY294002可減弱其改善作用。見表3。

表3 各組大鼠腓腸肌恢復(fù)率對(duì)比

2.4 各組大鼠坐骨神經(jīng)MVD對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組坐骨神經(jīng)MVD升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明受壓坐骨神經(jīng)的MVD增加。與模型組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組的坐骨神經(jīng)MVD升高(P<0.05)。與電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+LY294002組坐骨神經(jīng)MVD降低(P<0.05)。結(jié)果表明，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可促進(jìn)坐骨神經(jīng)血管新生，LY294002可減弱其作用。見表4和圖1。

表4 各組大鼠坐骨神經(jīng)MVD對(duì)比 條·視

A：坐骨神經(jīng)CD34表達(dá)量少B、C、D組：坐骨神經(jīng)CD34表達(dá)量增加，其中C>D>B圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)CD34陽性表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色法，×400，標(biāo)尺25 μm)

2.5 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織病理學(xué)形態(tài)對(duì)比

假手術(shù)組：神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)纖維排列整齊，神經(jīng)元軸突、髓鞘連接正常。模型組：神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，神經(jīng)纖維排列紊亂，神經(jīng)元軸突、髓鞘連接斷裂，細(xì)胞腫脹變性。電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+LY294002組：神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)較清晰，神經(jīng)纖維排列較為整齊，出現(xiàn)明顯增生，部分神經(jīng)元軸突、髓鞘連接斷裂，細(xì)胞增殖現(xiàn)象明顯。電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組的組織病理學(xué)改善程度更優(yōu)。見圖2。

圖2 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色法，×400，標(biāo)尺25 μm)

2.6 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組坐骨神經(jīng)組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明受壓坐骨神經(jīng)大鼠PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性增強(qiáng)。與模型組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組坐骨神經(jīng)組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值升高(P<0.05)。與電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+LY294002組坐骨神經(jīng)組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值降低(P<0.05)。結(jié)果表明，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可促進(jìn)受壓坐骨神經(jīng)大鼠PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性增強(qiáng)，LY294002可減弱其作用。見表5和圖3。

表5 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織Akt/p-Akt 、mTOR/p-mTOR對(duì)比

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組；D.電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組+LY294002組圖3 各組AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)對(duì)比(Western blot法)

3 討 論

坐骨神經(jīng)損傷表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)、感覺的功能障礙，即主動(dòng)運(yùn)動(dòng)消失、肌無力、肌萎縮、感覺減退、出汗減少、皮膚粗糙、角質(zhì)層薄化等[10]。坐骨神經(jīng)損傷屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“痿證”范疇，病機(jī)為邪風(fēng)痹阻經(jīng)脈、外感濕毒、飲食勞倦、跌打損傷等致肢體筋骨病變、血?dú)獗宰?、氣血虛耗、五臟傷損，從而發(fā)病，治療根本在于祛邪通絡(luò)、補(bǔ)虛固本。

神經(jīng)傳導(dǎo)速度體現(xiàn)了周圍神經(jīng)的傳導(dǎo)能力。坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)傳導(dǎo)能力受限，傳導(dǎo)速度降低[11]。小腿腓腸肌濕重是神經(jīng)功能恢復(fù)的重要指標(biāo)，可反映神經(jīng)纖維再生情況。坐骨神經(jīng)損傷可致肌力下降、肌肉萎縮，故肌肉濕重降低。神經(jīng)MVD與神經(jīng)再生、功能恢復(fù)速度密切相關(guān)[12]。CD34抗體是微血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，常用其標(biāo)記新生血管[13]。本研究結(jié)果顯示，與模型組對(duì)比，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)最大角度增加，神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快、腓腸肌恢復(fù)率升高、坐骨神經(jīng)MVD升高，提示電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提升大鼠肌力及運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)周圍神經(jīng)功能恢復(fù)、神經(jīng)微血管再生。有研究[14]認(rèn)為，電針可促進(jìn)家兔外周面神經(jīng)損傷的再生、面部神經(jīng)及肌肉功能恢復(fù)，抑制神經(jīng)元凋亡，提示電針對(duì)于神經(jīng)損傷具有治療作用。良好的血液循環(huán)是神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的基礎(chǔ)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可顯著改善血液供應(yīng)，加快血液循環(huán)速度，促進(jìn)神經(jīng)再生。電針與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合可發(fā)揮協(xié)同作用，提升肢體運(yùn)動(dòng)功能，強(qiáng)化周圍神經(jīng)損傷治療效果[15]。

PI3K/Akt/mTOR通路是機(jī)體經(jīng)典信號(hào)通路，廣泛參與機(jī)體能量吸收、基礎(chǔ)代謝等過程[16]。Akt是PI3K下游關(guān)鍵效應(yīng)分子，是一種重要生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)介質(zhì)，可發(fā)生磷酸化而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。mTOR是Akt下游重要靶蛋白，可被活化的Akt激活發(fā)生磷酸化，間接激活效應(yīng)分子蛋白，參與神經(jīng)元突觸形成，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)分化[17]。研究[18]認(rèn)為，激活PI3K/Akt通路可減少坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，在神經(jīng)功能的再生和重建過程中起到關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組對(duì)比，模型組坐骨神經(jīng)組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高，經(jīng)電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后進(jìn)一步升高，且在電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練基礎(chǔ)上增用PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制劑LY294002可減弱電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠受壓坐骨神經(jīng)再生的促進(jìn)作用，提示電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能通過調(diào)控該通路促進(jìn)大鼠受壓坐骨神經(jīng)再生。

綜上所述，電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可促進(jìn)大鼠受壓坐骨神經(jīng)再生及肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。