曾碧君，何勇，童許萍，張予，楊志波

（1.湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.貴州朗佑堂制藥有限公司，貴州 丹寨 557500）

皮膚是人體抵御多種外部病原體和環(huán)境危害的第一道防線，有重要的自我平衡功能，如減少水分流失和有助于身體溫度調(diào)節(jié)。然而，隨著年齡的增長，皮膚結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表皮和真皮層變薄，水分流失增加，膠原蛋白和彈性蛋白碎裂[1]。老年人皮膚常出現(xiàn)干燥、菲薄、粗糙、皮下脂肪少，有鱗屑、角化等現(xiàn)象[2]。靶向皮膚的激素狀態(tài)或其表面營養(yǎng)，可以減緩年齡引起的皮膚氧化，減緩老年人皮膚干燥、脫屑和瘙癢的癥狀，有助于修護皮膚屏障[3]。近年來文獻報道，中藥成份有抗老化及增加皮膚水分的作用[4]。開發(fā)以中草藥為主要有效成分的藥浴乳來延緩皮膚衰老，已成為皮膚保濕和抗氧化研究的新方向。沐耄舒是貴州朗佑堂制藥有限公司生產(chǎn)的中老年人專用藥浴乳，本研究擬采用人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT）為研究對象，從皮膚保濕與屏障功能、抗氧化功能、角質(zhì)細(xì)胞炎性等方面，探究沐耄舒藥浴乳中藥成分浸提液對角質(zhì)細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 HaCaT 細(xì)胞株購自來源于中科院上海細(xì)胞庫，復(fù)蘇后應(yīng)用。HaCaT 在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%二氧化碳（CO2）條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自美國Thermo Fisher 公司；脂多糖（LPS）和干擾素-γ（IFN-γ）購自美國PeproTech 公司；RNAiso Plus、cDNA 第一合成試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司；qRT-PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。水通道蛋白（Aquaporin 3）、絲聚合蛋白（Filaggrin）、兜甲蛋白（Loricrin）及內(nèi)披蛋白（Involucrin）等本研究所用所有蛋白相應(yīng)抗體均購自美國Thermo Fisher 公司。

1.2 方法

1.2.1 沐耄舒藥浴乳中藥成分浸提液的制備 沐耄舒藥浴乳主要由人參、淫羊藿、墨旱蓮、苦參、白鮮皮、地膚子、牡丹皮、玄參、當(dāng)歸、玉竹、麥冬、天冬、豨薟草、防風(fēng)、土茯苓、槐枝、桑葉和薄荷組成。以上所有藥物均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，按《中華人民共和國藥典》規(guī)定的有關(guān)工藝操作方法進行中藥成分浸提液的制備，將18種藥材分別按照沐耄舒藥浴乳配方中的組成比例用沸水進行多次煎煮提取，合并藥液后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液進行濃縮，最終使浸提液濃度為每毫升相當(dāng)于原藥材1.0 g，分裝，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 浸提液濃度篩選 HaCaT 細(xì)胞以5×103個/孔的密度鋪種于96 板中，每孔約100 μL 細(xì)胞懸液，同一樣本做3 個或以上復(fù)孔；將接種好的細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞完全貼壁；分別加入0、10、20、50 和100 mg/mL 的浸提液，然后分別于0 h、24 h 和48 h，每孔加入10 μL CCK8 試劑，混勻；37 ℃孵育2 h 后，測定450 nm 處的吸光度，根據(jù)OD 值進行組間的統(tǒng)計分析。

1.3 浸提液對角質(zhì)細(xì)胞皮膚保濕與屏障功能的影響 按常規(guī)方法培養(yǎng)HaCaT 細(xì)胞并加入16 孔板，然后加入浸提液處理30 min，對照組加入對應(yīng)量的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），收集細(xì)胞待用。①采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞中透明質(zhì)酸含量，具體方法參照試劑盒說明書。②提取RNA，以GAPDH 基因作為內(nèi)參，采用qRT-PCR 檢測透明質(zhì)酸的合成酶HAS1，HAS2 和HAS3 的mRNA 表達水平。qRT-PCR 實驗條件如下，53 ℃：2 min；95 ℃：10 min；95 ℃：15 s；60 ℃：1 min，共40 個循環(huán)。③采用Western blot 檢測透明質(zhì)酸的合成酶1（HAS1），HAS2 和HAS3 及皮膚保濕與屏障修復(fù)相關(guān)因子Aquaporin 3，F(xiàn)ilaggrin，Loricrin 及Involucrin 蛋白表達水平。每組3 個重復(fù)。

1.4 浸提液對角質(zhì)細(xì)胞抗氧化功能的影響 ①流式細(xì)胞術(shù)檢測HaCaT 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量：以1×105/孔接種細(xì)胞于6 孔板內(nèi)，設(shè)置實驗分組為陰性對照PBS 組、H2O2（500 μmol/L，12 h）處理組、浸提液組及H2O2處理組+浸提液組。待藥物刺激24 h 后，用無血清培養(yǎng)基稀釋2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA），使其終濃度為10 μmol/L，每孔加入1 mL DCFH-DA溶液。37 ℃避光孵育細(xì)胞20 min 后，移去培養(yǎng)基，PBS 漂洗3 次，然后離心收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀（激發(fā)光波長525 nm）對樣本進行檢測，每個樣品檢測1×104個細(xì)胞，Cell Quest 軟件分析結(jié)果。實驗過程需避光[5]。②采用氮藍四唑（NBT）光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[6]；采用高效液相色譜法（HPLC）法測定谷胱甘肽（GSH）含量[7]。③Western blot 檢測抗氧化蛋白核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子-2（Nrf-2）、血紅素氧合酶-1（HO-1）的蛋白表達水平。

1.5 浸提液對LPS/IFN-γ 誘導(dǎo)的角質(zhì)細(xì)胞炎性的影響 以1×106個細(xì)胞/孔將收集的HaCaT 細(xì)胞鋪于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置實驗分組為PBS、LPS（1 μg/mL）/IFN-γ（50 ng/mL）、MMS、LPS/IFN-γ+MMS。HaCaT 在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，LPS/IFN-γ 處理組加入1 μg/mL LPS 培養(yǎng)24 h或者50 ng/mL IFN-γ 培養(yǎng)48 h。收集誘導(dǎo)處理7 d后的細(xì)胞，提取RNA 并逆轉(zhuǎn)錄，用qRT-PCR 檢測其中炎性因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），環(huán)加氧酶2（PTGS2）的表達量。

2 結(jié)果

2.1 浸提液濃度篩選 為研究沐耄舒藥浴乳中藥成分浸提液（MMS）對角質(zhì)細(xì)胞影響，采用不同濃度的MMS 分別處理角質(zhì)細(xì)胞0 h、24 h、48 h，篩選適合角質(zhì)細(xì)胞生長的沐耄舒藥浴乳中藥成分浸提液濃度。不同濃度及不同處理時間其對HaCaT 細(xì)胞增殖的影響，見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度MMS 對角質(zhì)細(xì)胞的增殖效果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 不同濃度MMS 處理角質(zhì)細(xì)胞的增殖情況

2.2 檢測浸提液促進角質(zhì)細(xì)胞皮膚保濕與屏障功能 MMS 處理后，HaCaT 細(xì)胞的透明質(zhì)酸含量明顯升高，見圖2A。同時利用qRT-PCR 及Western blot檢測透明質(zhì)酸的合成酶HAS1，HAS2 和HAS3 的表達，發(fā)現(xiàn)MMS 處理后，透明質(zhì)酸的合成酶HAS1，HAS2 和HAS3 的表達量明顯增加，見圖2B。進一步檢測發(fā)現(xiàn)HaCaT 細(xì)胞中皮膚關(guān)鍵因子Aquaporin 3，F(xiàn)ilaggrin，Loricrin 及Involucrin 表達量明顯增加，見圖2C、D，這4 個因子在機體維持水代謝、角質(zhì)化被膜形成及皮膚表皮角層屏障構(gòu)成過程中有重要作用[8]。說明MMS 能夠促進角質(zhì)細(xì)胞皮膚保濕并增強其屏障功能。

圖2 MMS 對HaCaT 細(xì)胞透明質(zhì)酸含量及皮膚保濕及屏障功能相關(guān)因子表達水平的影響

2.3 浸提液促進角質(zhì)細(xì)胞抗氧化功能 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組HaCaT 細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PBS 組相比，MMS 組證明MMS 能夠明顯減弱角質(zhì)細(xì)胞ROS 含量；而H2O2能夠顯著誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量。并且與H2O2處理后的HaCaT 細(xì)胞相比，H2O2+MMS 組證明MMS 能夠明顯清除H2O2處理角質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)增加的ROS 含量，見圖3A，并增強角質(zhì)細(xì)胞SOD 活性及GSH 含量，見圖3B、C。進一步檢測抗氧化相關(guān)因子Nrf2 和HO-1 的表達，發(fā)現(xiàn)MMS 處理后，Nrf-2 和HO-1 顯著上調(diào)表達，見圖3D。以上結(jié)果提示MMS 處理能夠明顯增強HaCaT 細(xì)胞的抗氧化功能。

圖3 MMS 對HaCaT 細(xì)胞抗氧化功能的影響

2.4 浸提液對LPS/IFN-γ 誘導(dǎo)的角質(zhì)細(xì)胞炎性的影響 設(shè)置PBS、LPS（1 μg/mL）、MMS、LPS+MMS 分別處理24 h 后，qRT-PCR 檢測炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、PTGS2 的表達，見圖4。MMS 處理后IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量明顯降低，PTGS2 表達量顯著升高。LPS 誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)后，MSS 處理也顯著減弱炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的高表達，恢復(fù)PTGS2 的表達。進一步設(shè)置PBS、IFN-γ（50 ng/mL）、MMS、LPS+MMS 分別處理48 h 后，同樣發(fā)現(xiàn)MMS 處理后IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量明顯降低，PTGS2 表達量顯著升高。并且IFN-γ 誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞免疫能力后，MSS 處理也顯著減弱炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的高表達，恢復(fù)PTGS2 的表達。結(jié)果證明，MMS 處理后能夠顯著減弱LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng)。

圖4 MMS 對LPS/IFN-γ 誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng)的影響

3 討論

皮膚細(xì)胞的更新速度，會隨著年齡的增長而減慢。有文獻報道，年輕人的表皮細(xì)胞大約每21 天更新1 次，然而老年人卻需要2 倍甚至更多的時間[9]。并且，老年人真皮會逐漸萎縮，厚度減少約20%，導(dǎo)致皮膚變得薄而透明，容易干燥和瘙癢。據(jù)統(tǒng)計，在65～75 歲的人群中，有約55%的人群患有嚴(yán)重的皮膚疾病[10]。因此，保持皮膚水分、修護皮膚屏障功能是預(yù)防老年人皮膚衰老和瘙癢的重要的途徑。

皮膚老化及損傷涉及皮膚組織的各種生理變化，在老化的皮膚中，真皮細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分膠原纖維的降解，水通道蛋白（AQP3）和皮膚成分（如透明質(zhì)酸和神經(jīng)酰胺）的變化，造成皺紋和減少皮膚保濕，從而導(dǎo)致皮膚干燥和缺乏彈性[11]。因炎性反應(yīng)增加會促進凋亡細(xì)胞的死亡，被認(rèn)為是皮膚衰老及衰老相關(guān)疾病的主要致病因素之一[12]；此外，大量研究提出氧化損傷是皮膚衰老的一個重要原因[13]，ROS 能夠通過影響機體內(nèi)抗氧化酶如SOD 等的表達及GSH 水平，從而改變細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)功能，在角質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷中發(fā)揮重要作用[14]。

目前中藥在改善皮膚水分及抗氧化應(yīng)激、抗炎等方面的作用受到研究者越來越多的關(guān)注，中藥類的護膚產(chǎn)品也逐漸受到大家的青睞。沐耄舒是專門針對老年人皮膚干燥、脫屑和瘙癢研發(fā)的藥浴乳，亦適用于中老年人群的日常皮膚清潔護理。本研究對沐耄舒藥浴乳中藥成分浸提液對HaCaT 細(xì)胞的在屏障功能、抗氧化及炎性反應(yīng)的影響進行了研究，發(fā)現(xiàn)該浸提液對HaCaT 細(xì)胞皮膚保濕以及屏障功能均有良好的促進作用，可以通過減少角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量、增加GSH 含量、影響氧化應(yīng)激相關(guān)酶類的表達而促進HaCaT 細(xì)胞抗氧化功能，從而減少角質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷，也能夠減弱角質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，改善人體皮膚。沐耄舒藥浴乳配方中玄參、當(dāng)歸和地膚子清除氧化自由基能力較強，有很好的抗氧化及抗炎作用[15-17]；苦參被報道有抑制HaCaT 細(xì)胞增殖的作用，在皮膚科的治療中應(yīng)用廣泛[18]；玉竹對HaCaT 細(xì)胞抑制氧化損傷，增強細(xì)胞抗氧化能力有重要的作用[19]；防風(fēng)、天冬、土茯苓等在老年皮膚瘙癢、皮膚保濕及多種皮膚病的緩解和治療中有較好的功效[20-22]；臨床研究表明丹皮酚可以抗炎、鎮(zhèn)痛、止癢，對老年人皮膚瘙癢癥有良好的治療效果[23]。

綜上，本研究首次證明沐耄舒藥浴乳中藥成分浸提液能夠從多方面減少角質(zhì)細(xì)胞的損傷，促進人體皮膚健康。為沐耄舒藥浴乳對中老年人群皮膚有潤燥祛屑、疏風(fēng)止癢、修護皮膚屏障的功效奠定了理論依據(jù)。