魯曦澤，姜宇凡，李英華，郝嘉言，譚文宇，任曉宇

(東北大學(xué) 資源與土木工程學(xué)院， 沈陽 110000)

0 引 言

納米銀由于其獨(dú)特的導(dǎo)電性、抑菌性、抗氧化性和表面活性高等優(yōu)點(diǎn)備受社會關(guān)注，在催化材料、低溫超導(dǎo)材料和家電醫(yī)療等領(lǐng)域擁有非常廣闊的應(yīng)用價值[1]。因此，探究納米銀粒子的制備與應(yīng)用具有重要意義[2]。

目前，納米銀的合成方法很多，按原理的不同可分為物理合成法[3]、化學(xué)合成法[4]和生物合成法[5]。其中化學(xué)合成法在工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛，具有設(shè)備簡單、操作方便和反應(yīng)條件溫和以及成本較低等優(yōu)點(diǎn)[6]。魯志強(qiáng)等采用液相化學(xué)還原法，以硼氫化鈉為還原劑，硝酸銀為前驅(qū)體，PVA(聚乙烯醇)為分散劑，制備出高純度的納米銀粉[7]；魏春萍利用PVP作為分散劑，硼氫化鈉為還原劑制備納米銀，同時對納米銀在不同分散介質(zhì)下的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，以硝酸銀為銀源制得的產(chǎn)品，存在高表面能導(dǎo)致的團(tuán)聚沉降問題。而以[Ag(NH3)2]OH溶液為前驅(qū)體制備的納米銀膠體品質(zhì)有較大改善[8]。隨著納米銀被廣泛應(yīng)用的同時，其所帶來的環(huán)境效應(yīng)日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。納米銀產(chǎn)品的過量使用勢必導(dǎo)致納米銀進(jìn)入環(huán)境中，其自身存在的生物毒性對生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能產(chǎn)生一定的影響[9-10]。同樣會影響天然水體中反硝化菌的生存與行為，擾亂生物脫氮過程，進(jìn)而破壞自然界中的氮循環(huán)[11]。

針對納米銀制備過程中存在的問題，本研究以檸檬酸鈉和乙醇為還原劑，[Ag(NH3)2]OH溶液為前驅(qū)體，檸檬酸鈉和聚乙烯吡咯烷酮為保護(hù)劑，在水浴加熱條件下制備得到納米銀溶液。進(jìn)一步，以反硝化無色桿菌為模式菌株，探究所制備的納米銀對其毒性作用及機(jī)理。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

硝酸銀、檸檬酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、無水乙醇、氨水均為分析純國產(chǎn)試劑。反硝化無色桿菌Achromobacterdenitrificans購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院(BNCC135026)。擴(kuò)大培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基; 氨化培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，NaCl 0.25，KCl 0.3，K2HPO40.25，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，pH 7.0～7.5; 硝化培養(yǎng)基(g/L)：NH4SO40.47，C6H12O62.5，MgSO40.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，CaCl20.02，K2HPO41，KH2PO41，pH 7.0～7.5。

JJ-1H數(shù)顯恒速電動攪拌器(常州榮華儀器制造有限公司)；紫外-可見分光光度儀(UV-2501PC)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(ULTRA PLUS)；場發(fā)射透射電子顯微鏡(G20)；多晶X射線衍射儀(Pertpro)；Zeta電位儀(Zetasizer Nano S)。

1.2 納米銀制備

本研究用檸檬酸鈉和乙醇按一定配比制成20 mL還原溶液，后加入定量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為保護(hù)劑。取20 mL一定濃度的銀氨溶液置于三口燒瓶中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為450 r/min，水浴加熱，隨后逐滴加入還原溶液(2 mL/min)，反應(yīng)一段時間后制得納米銀溶液。超聲震蕩后用無水乙醇洗滌3次得到納米銀膠體。

1.3 最佳制備條件的探究

研究發(fā)現(xiàn)，銀氨濃度、反應(yīng)底物摩爾比、反應(yīng)溫度和時間是影響納米銀制備的關(guān)鍵因素，利用單因素控制變量法探究各因素的最佳反應(yīng)條件。

最佳反應(yīng)時間的探究：將0.005 mol/L的硝酸銀溶液配成銀氨溶液，按一定底物摩爾比(n(檸檬酸鈉)∶n(無水乙醇)∶n(硝酸銀)=1∶15∶1)配制還原溶液，后加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31.2%的PVP，攪拌均勻后按上述步驟進(jìn)行反應(yīng)，于不同時間點(diǎn)(60、75、90、105 min)采樣。樣品稀釋一定倍數(shù)后用紫外-可見分光光度儀進(jìn)行檢測，分析比較紫外可見光吸收曲線，選擇最佳反應(yīng)時間。

其余反應(yīng)條件的探究：改變無水乙醇：硝酸銀的摩爾比為8∶1、10∶1、12∶1、 18∶1、20∶1；硝酸銀濃度為0.001、0.003、0.008、0.010 mol/L；反應(yīng)溫度為80、85、90、95 ℃，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行取樣、檢測。探究不同的反應(yīng)底物摩爾比、銀氨溶液濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對納米銀的影響。

1.4 納米銀的表征

確定最佳反應(yīng)條件后，將濃度為0.005 mol/L的AgNO3溶液制備的納米銀膠體樣品置于離心機(jī)在11 000 r/min下離心，用無水乙醇洗滌數(shù)次，烘干得到純凈的納米銀粉末，隨后將制備的樣品分別利用XRD、SEM、TEM以及EDS分析、激光粒度分析和Zeta電位分析技術(shù)進(jìn)行表征，從而判斷納米銀產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)以及形貌特性。

1.5 納米銀對反硝化無色桿菌生長特征的影響

將細(xì)菌接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使得初始OD600為0.07，高溫滅菌后加入AgNPs儲備液,控制培養(yǎng)液中AgNPs濃度梯度為0、1、5、10、15、20 mg/L，37 ℃、150 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng),定期取樣檢測OD600,設(shè)置兩個重復(fù)對照組。

1.6 納米銀對反硝化無色桿菌生理活性的影響

1.7 細(xì)胞膜完整性分析

1.7.1 LDH檢測

乳酸脫氫酶(LDH)是一種細(xì)胞質(zhì)酶，在細(xì)胞體內(nèi)含量豐富，當(dāng)胞膜破裂后釋放在細(xì)胞體外，利用培養(yǎng)基中的LDH釋放率檢測暴露培養(yǎng)后細(xì)胞膜破裂情況。利用試劑盒(碧云天)檢測LDH活性，具體操作詳見說明書。

1.7.2 掃面電鏡觀察

細(xì)菌掃面電鏡樣品制備方法參照伍玲麗等[12]的方法：取適量經(jīng)梯度濃度為0、2、6、10 mg/L的AgNPs暴露培養(yǎng)12 h后的細(xì)菌溶液，進(jìn)行高速冷凍離心-2.5%戊二醛固定-乙醇梯度脫水-乙酸異戊酯替代等步驟，每個步驟進(jìn)行前用PBS緩沖溶液將樣品沖洗干凈，40 ℃下干燥4～6 h，收集樣品進(jìn)行掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳制備條件的探究

2.1.1 反應(yīng)時間的影響

利用樣品在波長300～700 nm范圍的紫外共振吸收曲線探究反應(yīng)時間對納米銀膠體的影響，結(jié)果如圖1(a)所示，隨著反應(yīng)時間的增加，各曲線均在波長432 nm左右出現(xiàn)最大吸收峰，峰值位置未發(fā)生偏移，峰值隨時間變化先增大后減小，在90 min達(dá)到最大，表明反應(yīng)90 min時納米銀的產(chǎn)率達(dá)到最大。反應(yīng)不同時間后曲線的半峰全寬無明顯變化，表明粒徑分布范圍差異不大。因此綜合以上因素，納米銀制備的最佳反應(yīng)時間為90 min。

2.1.2 底物摩爾比的影響

關(guān)于硝酸銀與乙醇反應(yīng)底物摩爾比的探究實(shí)驗(yàn)，測量其紫外吸收曲線，結(jié)果如圖1(b)所示。隨著乙醇比例的增加，最大吸收峰位置出現(xiàn)先藍(lán)移(左移)后紅移(右移)的現(xiàn)象，表明納米銀粒徑隨乙醇濃度的增加先增大后減小，當(dāng)硝酸銀與乙醇濃度比為1∶15時，曲線在波長431 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，小于其它曲對應(yīng)的吸收峰位置，相較其他條件，該條件制備的納米銀膠體平均粒徑較小。且該曲線半峰寬寬度小于其他曲線，說明該條件所得到的納米銀粒度分布較均勻。摩爾比為1∶10條件對應(yīng)曲線的吸光度為3.447，高于摩爾比為1∶15對應(yīng)曲線的吸光度(3.32)，說明摩爾比1∶10對應(yīng)的條件下納米銀濃度高、產(chǎn)率大，但是該條件對應(yīng)曲線的半峰寬較寬，特征吸收峰位置也較大(440 nm)。綜合考慮，選擇最佳摩爾比為1∶15。

2.1.3 硝酸銀濃度的影響

不同硝酸銀濃度所對應(yīng)的紫外吸收曲線如圖1(c)所示。對比發(fā)現(xiàn)，隨著硝酸銀濃度增加，從左至右，納米銀最大吸收峰均出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，這說明不同濃度的前驅(qū)體制備出的納米銀膠體的粒徑亦不相同。即隨著前驅(qū)體濃度增加，納米銀膠體粒徑增加。此外，由0.001和0.01 mol/L所對應(yīng)的曲線高度以及半峰寬可知，過低和過高的硝酸銀濃度均會導(dǎo)致生成的納米銀膠體易存在粒度分布不均、濃度較低等問題。在該濃度范圍內(nèi)，相較于其他曲線，硝酸銀濃度為0.005 mol/L對應(yīng)的分光曲線峰值最大、半峰寬最窄且吸收峰位置最小，因此選擇硝酸銀最佳反應(yīng)濃度為0.005 mol/L。

2.1.4 反應(yīng)溫度的影響

圖1(d)為不同溫度條件下納米銀紫外吸收曲線。隨著溫度的升高，最大吸收峰出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象，這表明：溫度越高，所制備的納米銀膠體粒徑越?。磺译S著溫度逐漸上升，對應(yīng)吸收曲線的半峰寬逐漸變窄、峰值亦逐漸變大，表明：溫度越高，納米銀膠體粒度分布越均勻、納米銀濃度也越大。因此選擇最佳反應(yīng)溫度為100 ℃。

圖1 不同條件下的紫外曲線Fig 1 UV curves at different preparation condition

2.2 納米銀的表征分析

2.2.1 X射線衍射(XRD)分析

圖2為經(jīng)過上述較優(yōu)條件制得的納米銀X射線衍射(XRD)譜。

圖2 納米銀X射線衍射譜圖Fig 2 X-ray diffraction XRD spectrum of nano-silver

從圖2中可以看出，樣品的特征衍射峰二倍衍射角2θ值依次為38.114°，44.298°，64.441°，77.395 °和81.538 °,分別對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)晶態(tài)銀卡片Silver 3C-Ag(87-0597)的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)衍射峰，無其他雜質(zhì)峰存在，說明用該方法制得的納米銀顆粒是高純度的單質(zhì)銀。利用Scherrer公式計算納米銀粒子平均粒徑，如式(1)所示[13]，

D=Rλ/βcosθ

(1)

式中：D為粒子直徑，nm；R為Scherrer常數(shù)，0.89；λ為入射X射線波長，nm；θ為衍射角，(°)；β為衍射峰的半峰寬，rad。

經(jīng)過計算，得單質(zhì)銀平均粒徑約為49.3 nm。

2.2.2 納米銀膠體的形貌分析

將最佳制備條件下制得的納米銀膠體置于離心機(jī)在11 000 r/min下離心，用無水乙醇洗滌3次，得到純凈的納米銀溶液。將其烘干、制樣后利用SEM進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3所示。

SEM圖中觀察可知，制得的銀納米顆粒近似呈球形，粒徑主要分布在50～60 nm之間，且樣品粒度分布較均勻，形貌大小易控制，在可考慮誤差范圍內(nèi)，與上述X射線衍射(XRD)分析結(jié)果近似一致。取少量上述純凈納米銀溶液并分散在銅網(wǎng)附有碳膜支持的一面。將銅網(wǎng)烘干后，進(jìn)行TEM分析表征，結(jié)果如圖4所示。

圖3 納米銀掃描電鏡圖Fig 3 Nano-silver scanning electron microscope spectrum

圖4 納米銀透射電鏡圖Fig 4 TEM image of nano-silver

由圖4結(jié)果可見，納米銀顆粒近似為球形，粒徑主要分布在50～60 nm處，且粒度分布依舊較為均勻，與上述SEM及XRD結(jié)果差別不大。

2.2.3 激光粒度分析和Zeta電位分析

圖5、6分別為銀納米顆粒的激光粒度分析及Zeta電位分析圖。粒度分析顯示銀納米顆粒的流體動力學(xué)直徑為68.27 nm，略大于透射電鏡表征得到的平均粒徑。Zeta電位分析顯示其平均Zeta電位為27.8 mV，電位標(biāo)準(zhǔn)差為37.8 mV，體系存在較高電位。在1940年代Dergajaguin等提出了描述膠體穩(wěn)定的理論[14-15]：膠體體系的穩(wěn)定性是當(dāng)顆粒相互接近時它們之間的雙電層互斥力與范德瓦爾互吸力的凈結(jié)果；當(dāng)顆粒接近時顆粒之間的能量障礙來自于互斥力，當(dāng)顆粒有足夠的能量克服此障礙時，互吸力將使顆粒進(jìn)一步接近并不可逆的粘在一起。因此Zeta電位則可以成為判定膠體穩(wěn)定性的指示，即：Zeta電位愈高，顆粒間的排斥作用就愈強(qiáng)，顆粒的分散體系愈穩(wěn)定。孫紅剛等利用次磷酸鈉為還原劑制得納米銀粉末，檢測其在純水中的Zeta<10 mV[16]。Yin等利用檸檬酸鈉為還原劑和保護(hù)劑制得球形納米銀，在純水中的Zeta電位為13.4 mV[17]。分析可知，本研究所制得的納米銀分散體系的穩(wěn)定性較強(qiáng)。

2.3 納米銀對細(xì)菌生長特征的影響

不同濃度AgNPs暴露培養(yǎng)后細(xì)菌生長狀況如下圖7所示。

圖5 納米銀激光粒度分析圖Fig 5 Particle size analysis of nano-silver laser

圖6 Zeta電位分布圖Fig 6 Zeta potential distribution diagram

圖7 不同濃度AgNPs培養(yǎng)后細(xì)菌生長曲線Fig 7 Bacterial growth curves after culture with different concentrations of AgNPs

觀察可知，隨著AgNPs濃度的增加，細(xì)菌對數(shù)期的增長速率逐漸降低，進(jìn)入穩(wěn)定期后的細(xì)菌數(shù)量也逐漸減少，表明細(xì)菌的生長速率與AgNPs濃度負(fù)相關(guān)。空白組與AgNPs濃度為1 mg/L的投加系統(tǒng)相比，生長趨勢接近，培養(yǎng)時間超過8 h后進(jìn)入快速增值期，24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。當(dāng)AgNPs投加濃度為5 mg/L時，增殖期內(nèi)細(xì)菌生長速率與空白組相比明顯降低。AgNPs投加濃度為20 mg/L時，整個48 h培育期內(nèi)，細(xì)菌數(shù)量無明顯增加，該濃度下的細(xì)菌基本喪失生長活性。

2.4 納米銀對細(xì)菌生理活性的影響

圖8 兩種培養(yǎng)條件下納米銀對細(xì)菌氮轉(zhuǎn)化能力的影響Fig 8 The effect of nano-silver on the nitrogen conversion ability of bacteria under two culture conditions

部分學(xué)者研究認(rèn)為，粒徑處于5～10 nm范圍的納米銀可通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，釋放出Ag+，導(dǎo)致胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生累積，線粒體膜通透性發(fā)生改變，從而破壞細(xì)胞代謝平衡[18-19]。本研究中在此濃度范圍的納米銀可直接穿過細(xì)胞膜，抑制細(xì)菌的氮轉(zhuǎn)化過程，并且隨著納米銀投加濃度的增加，釋放出的Ag+濃度隨之增多，而環(huán)境中的有機(jī)質(zhì)可將Ag+還原為Ag[20]，零價狀態(tài)的Ag互相聚集，導(dǎo)致溶液中小顆粒的納米銀數(shù)量增加，對細(xì)菌的代謝抑制作用增強(qiáng)，氨化培養(yǎng)基中納米銀的毒性作用強(qiáng)于硝化培養(yǎng)基中的毒性作用。

2.5 納米銀對細(xì)胞膜完整性的影響

2.5.1 掃描電鏡分析

利用SEM觀察不同劑量納米銀(0、5、10、20 mg/L)暴露培養(yǎng)下細(xì)菌表面形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖9所示；

觀察圖9可知，細(xì)菌表面光滑，結(jié)構(gòu)飽滿，此時的細(xì)菌正處于對數(shù)期，代謝旺盛，基本未出現(xiàn)破碎的細(xì)胞膜。圖9(b)-(d)顯示納米銀的投加導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生褶皺，膜表面出現(xiàn)大小不均的孔洞和塌陷部位，并且隨著濃度的提高，不規(guī)則形態(tài)的細(xì)菌數(shù)量增多，部分細(xì)菌細(xì)胞膜完全破裂。Liu等研究發(fā)現(xiàn)納米銀可粘附在細(xì)胞膜表面，與膜表面的含硫蛋白相結(jié)合，造成胞膜破裂，出現(xiàn)“坑洞”，胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，本研究中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果與之相一致。

圖9 不同濃度納米銀暴露培養(yǎng)后細(xì)菌掃描電鏡Fig 9 Scanning electron micrograph of bacteria under varying concentration of nanosilver exposure

2.5.2 乳酸脫氫酶分析

利用乳酸脫氫酶(LDH)的研究可分析細(xì)胞膜完整性，檢測空白組培養(yǎng)基中LDH的釋放量為0.047 U/L，假設(shè)空白組中納米銀的釋放率為100%，則暴露培養(yǎng)后培養(yǎng)基中的釋放情況如下圖10所示；

圖10 納米銀對細(xì)菌LDH釋放的影響Fig 10 The effect of nano silver on the release of bacterial LDH

觀察圖10可以看出，隨著AgNPs投加濃度的提高，LDH釋放率隨之增加，對細(xì)胞膜的破壞作用愈加顯著。當(dāng)AgNPs投加濃度為1 mg/L時，LDH釋放率為109%，與空白組對比無明顯差異，表明對細(xì)胞膜無明顯作用，該濃度下的細(xì)菌生長狀態(tài)與空白組相比無太大差距。當(dāng)AgNPs投加濃度為10和20 mg/L時，LDH釋放率分別為175%和323%，都較空白組顯著增多，表明在此培養(yǎng)條件下，細(xì)胞膜受到明顯破壞作用，結(jié)合掃描電鏡結(jié)果分析可知，AgNPs可接觸細(xì)胞表面，破壞表層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂出現(xiàn)“坑洞”。

LDH釋放的研究驗(yàn)證了AgNPs對細(xì)胞膜的破壞情況，隨著AgNPs投加濃度的增加，細(xì)胞膜的表面不再光滑，出現(xiàn)褶皺，部分細(xì)胞膜破裂，完整性遭到破壞，胞內(nèi)物質(zhì)流出。

3 結(jié) 論

(1)以銀氨溶液為前驅(qū)體，檸檬酸鈉和無水乙醇為還原劑，PVP與檸檬酸鈉為保護(hù)劑，在一定反應(yīng)條件下成功制得納米銀，利用單因素分析法對影響納米銀制備的反應(yīng)時間、底物摩爾比、硝酸銀濃度、反應(yīng)溫度等條件進(jìn)行探究，結(jié)果表明其最佳制備條件為：反應(yīng)時間90 min、硝酸銀與無水乙醇的摩爾比1∶15、硝酸銀濃度0.005 mol/L、反應(yīng)溫度100 ℃。在此條件下納米銀的紫外吸收曲線峰值位于420 nm左右，半峰全寬最窄，峰值較高，表明納米銀粒徑分布范圍小，產(chǎn)率高。

(2)利用SEM、TEM、激光粒度分析結(jié)果表明所制得的納米銀為球形顆粒，粒徑處于50～60 nm范圍，分布均勻，與紫外吸收曲線結(jié)果相符。Zeta電位為27.8 mV，XRD顯示其晶格為面心立方結(jié)構(gòu)。

(3)AgNPs可影響Achromobacterdenitrificans的生長以及氮降解能力，并且隨著AgNPs濃度的增加抑制作用越強(qiáng)。當(dāng)投加濃度達(dá)1 mg/L時，AgNPs對細(xì)菌的生長和氮轉(zhuǎn)化能力與空白組相比差異不大，當(dāng)投加濃度達(dá)20 mg/L時，細(xì)菌基本無生長，氮轉(zhuǎn)化能力明顯減弱。

(4)SEM以及LDH釋放分析結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的AgNPs可附著在細(xì)胞表面，破壞胞膜表面結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致表層膜發(fā)生破裂，胞內(nèi)物質(zhì)泄漏。納米銀對Achromobacterdenitrificans的毒性源于兩個方面，一方面小顆粒納米銀可直接進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)菌代謝紊亂，生理活動受損；另一方面納米銀可直接附著于細(xì)胞表面，導(dǎo)致細(xì)胞表層結(jié)構(gòu)受到損害，胞膜破裂。