王勁陽，楊福馨，陳晨偉，王廣林，柴 莉，陳祖國

(上海海洋大學 食品學院，上海 201306)

0 引 言

聚丙烯(PP)是一種性能良好的熱塑性材料，加工方式簡便多樣[1-2]，其無色、無臭、無毒，廣泛應用于機械、服裝、食品藥品包裝等領域[3-4]。隨著人們對食品安全越發(fā)重視，對高品質、綠色安全、更長貨架期的食品的需求也逐步提升[5]。傳統(tǒng)的將保鮮劑與防腐劑等加入到食品中，不僅會影響食品的風味，還會使食品的營養(yǎng)價值降低[6-7]。利用現有的加工技術將抑菌劑等活性物質加入到包裝材料中，使其兼具保護食品的基本品質并抑制微生物的生長繁殖達到保鮮作用[8-9]。這成為了目前具有良好的應用基礎與安全性的食品包裝的重要研究方向。

通常加入PP改性抑菌劑主要包括無機抗菌劑、合成抗菌劑和天然抗菌劑。無機抗菌劑主要是具有抗菌功能的金屬離子[10]。合成抗菌劑主要是通過物理化學反應制備的化工試劑。天然抗菌劑主要來自天然物的提取，如殼聚糖、甲殼素、中草藥提取物等，使用簡便，抗菌作用廣譜，且綠色無毒，對消費者的身心健康不會產生影響，可長期使用[11]。茴香酸在植物茴香菜中大量存在，在中醫(yī)中具有散熱、順氣、止痛的功效[12-13]；是香料的主要原料之一，同時在防腐、制藥等領域應用廣泛，其對霉菌具有較好的抑制效果[14]。李路等[15]探討了P-茴香醛對柑橘腐敗病菌的抑制能力與抑制機理，結合體外實驗表明，茴香醛能顯著抑制柑橘酸腐病原菌的生長，其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度均為4．48 g/L，能有效抑制柑橘果實酸腐的病原菌。兒茶素是酚類物質中一種，可從茶葉等植物中提取，約茶葉干重的30%，具有抗菌、延緩老化、除臭等多種作用[16-17]。有酯類兒茶素(EGCG、ECG)與非酯類兒茶素(EGC、EG)兩類，其中酯類兒茶素的抑菌效果明顯優(yōu)于非酯類，且對細菌的抑制效果優(yōu)于霉菌[18-19]。吳茜等[20]將兒茶素與殼聚糖復配，將制得的混合液用于研究對大腸埃希氏菌的抑制作用，結果表明，兒茶素與殼寡糖以1∶4復配時，有最佳的抑制效果。目前研究發(fā)現，兩種提取物均具有較好的抑菌活性，在醫(yī)療及食品保鮮中已有初步應用，但大多作為抑菌液的形式作用于食品表面，將其與聚合物混合作為包裝材料的研究較少。

本實驗以PP為主要基材，制備含不同質量分數的茴香酸、兒茶素的抑菌包裝薄膜，以常見的食品污染細菌大腸桿菌、真菌黑霉菌為實驗菌種，研究薄膜的微觀結果、力學性能、阻隔性能、抑菌性。并通過正交實驗的設計，檢測薄膜的抑菌持續(xù)性，為其在食品包裝鄰域的應用理論依據。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

聚丙烯(PP)：EPC30R-H，中國石油天然氣股份有限公司；茴香酸(Anisic acid)：含量>99.5%，山東優(yōu)索化工科技有限公司；兒茶素(EGCG)：含量>98%，上海招榕生物科技有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC25922)：農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)；黑霉菌：[CMCC(F)98003]標準菌種，農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)；鈦酯酸偶聯劑：NDZ-201型，上海源葉生物科技有限公司；平板計數瓊脂(PCA)，化學純，青島海博生物技術有限公司；BG-11培養(yǎng)基，化學純，青島海博生物技術有限公司；LB液體培養(yǎng)基：化學純，上海吉至生化科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA): 化學純，青島海博生物技術有限公司;實驗用水：蒸餾水。

1.2 儀器與設備

轉矩流變儀(XSS-300) 、雙螺桿擠出機(LSSJ-20) 、流延機(LYJ-300) 、切粒機(SG-20) ：上?？苿?chuàng)橡塑機械設備有限公司；智能電子拉力試驗機：XLW(EC) ，山東濟南蘭光機電技術有限公司；掃描電子顯微鏡：SU-5000(HitachiCo. Ltd, Matsuda, Japan)；傅立葉變換紅外光譜儀，ThermoFisherNicoletis5型，蘇州鈞詮儀器有限公司；分析天平：SZ-A30002，蘇州博泰偉業(yè)電子科技有限公司；潔凈工作臺：VS-1300L-U型，蘇州安泰空氣技術有限公司；恒溫培養(yǎng)震蕩箱：ZQTY-70N型，上海知楚儀器有限公司；恒溫鼓風干燥箱：GX-ZGF101，上海賀德實驗設備有限公司；反壓高溫蒸煮鍋：ZY-150F型，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司。

1.3 抑菌薄膜的制備

將茴香酸與兒茶素通過粉碎機進行粉碎，并過120目分樣篩過篩，將得到樣品按一定的質量比例通過NDZ-201鈦酯酸偶聯劑與PP樹脂在電動攪拌器的作用下均勻混合，并在50 ℃的烘箱里干燥2 h。將得到的物料通過雙螺桿造粒機進行熔融擠出，其中雙螺桿擠出造粒機的擠出工藝參數為：1-7區(qū)的溫度范圍為165～180 ℃，螺桿轉速為30 r/min，得到改性母粒。在將其與PP樹脂按照一定的比例混合均勻加入到塑料擠出機中通過流延制得薄膜。

表1 配方設計Table 1 Formulation design

1.4 抑菌薄膜性能測試

1.4.1 傅里葉紅外光譜分析(FT-IR)

利用傅里葉變換紅外光譜儀對薄膜進行檢測[21]，將樣品裁成1 cm×1 cm大小，每個樣品測定5個點位，測定時波長設定為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.4.2 掃描電子顯微鏡測試(SEM)

使用掃描電子顯微鏡觀察制得的抑菌薄膜的微觀形態(tài)[22]。將樣品在液氮中浸泡并快速脆斷，脆斷面朝上豎直貼附在樣品盤上。在離子濺射儀內抽真空并噴金處理，設置加速電壓為6.0 kV。

1.4.3 力學性能測試

參照國標GB/T1040.3-2006將樣品裁剪成15 mm×120 mm的條狀[23]，智能拉力機夾距設置為50 mm，拉伸速率300 mm/min。

1.4.4 阻隔性能測試

氧氣與水蒸氣是微生物生長繁殖的必備條件。薄膜的氧氣透過率參考ASTMD1434-82中的方法進行檢測[24]。水蒸氣透過率：參考ASTME96-00el測試，結束后計算結果。

1.4.5 MIC與MBC的測定

MIC的測定采用常量肉湯稀釋法[25];向每支滅菌試管中加入20 mL液體培養(yǎng)基，加入約106～107CFU/mL的大腸桿菌懸液0.1 mL以及0.1 mL的稀釋液，在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h；黑霉菌取濃度約105～106CFU/mL孢子懸液0.1 mL，在25 ℃下培養(yǎng)48 h。觀察試管中是否有細菌、菌斑生長。此外將1MIC、2MIC等樣液通過平板涂布培養(yǎng)，將無菌長出的濃度作為MBC。

1.4.6 抑菌薄膜對大腸桿菌抑制效果測定

稱取0.6 g的抑菌薄膜和純PP薄膜，將其裁成碎片后置于紫外滅菌2 h備用。將薄膜碎片放入無菌玻璃試管內，并加入10 mL胰蛋白胨大豆瓊脂液體培養(yǎng)基，將試管置于24 ℃、160 r/min的搖床內培養(yǎng)24 h，每隔2 h測其OD630值[26]，并記錄數據。

1.4.7 抑菌薄膜對黑霉菌抑制效果測定

在活化和培養(yǎng)一周后，向菌種斜面中添加5 mL生理鹽水，并刮除菌苔以制備細菌懸浮液。在試管中加入30 mL液體培養(yǎng)基，接種500 μL孢子懸浮液，加入1 g抑菌膜。在28 ℃下培養(yǎng)，并每隔一定時間取出。培養(yǎng)液在定量濾紙上抽濾，并在90 ℃下干燥，稱取細菌的干重并繪制生長曲線[27]。

1.4.8 薄膜抑菌圈測試

根據GB/T4789.2-2010[28]，用打孔器將膜裁成直徑為0.7 cm的圓片，然后紫外雙面滅菌各1 h；將1 mL濃度為105CFU/mL的大腸桿菌和106CFU/mL霉菌孢子懸液分別均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，將裁剪好的薄膜置于培養(yǎng)基中，然后在恒溫箱培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的大小。

1.4.9 薄膜的抑菌時效性測試

兩種抑菌劑的復配根據1.3所示，并考慮實際應用情況，稱取0.6 g的滅菌后的薄膜樣品放入無菌瓶中置于超凈臺內，每隔一段時間取出使用；以此為3個因素，每個因素3個水平確定正交試驗，并以抑菌率作為指標，正交試驗設計表如下所示。

表2 正交試驗因素水平設計表Table 2 Orthogonal test factor level design table

將1 mL菌懸液((1～2)×105CFU/mL)接種于每片薄膜樣品上，24 h后加入100 mL生理鹽水，進行梯度稀釋后接種于營養(yǎng)瓊脂上，在37 ℃下培養(yǎng)48 h后，進行菌落計數,與對照組相比較，計算抑菌率[29]。

2 結果與分析

2.1 薄膜的紅外光譜分析

不同比例的抑菌薄膜的紅外光譜如圖所示，其中在2 953 cm-1處有—CH3—不對稱伸縮振動，在2 910 cm-1處有—CH2—不對稱伸縮振動，在1 450 cm-1處有—CH2—彎曲振動，在1 377 cm-1處有—CH3對稱變形振動，此為聚丙烯的特征峰[30-31]。此外隨著茴香酸與兒茶素的加入之后逐漸明顯在3 356 cm-1處的-OH的特征峰，以及1 745 cm-1處的羰基的強吸收峰(—COOH)，說明薄膜中融合了茴香酸[32]；在1 223～1 237 cm-1出現了酯上的-C-O的伸縮振動峰，以及在825和766 cm-1處出現的1，3二取代苯上的=C-H 變形振動峰與1，2二取代苯上的=C-H 變形振動峰，這些都是EGCG的特有的特征峰[33]。由此可見茴香酸與兒茶素在高溫制備薄膜的過程中沒有揮發(fā)分解，沒有與PP發(fā)生化學反應，與薄膜保持了良好的相容性。

圖1 各組薄膜的紅外光譜圖Fig 1 Infrared spectra of each group of films

2.2 掃描電子顯微鏡測試(SEM)

圖2為各組抑菌薄膜截面在放大400倍數下的電鏡圖。由圖中可以看出， A、B兩組截面均平整、無凹凸、基本無褶皺、未出現團聚現象；C至E組薄膜出現略微褶皺與團聚; 這表明在流延成膜的過程中，茴香酸與兒茶素在高溫加工的過程中并沒有受熱揮發(fā)，沒有與PP發(fā)生交聯反應，在PP中分散均勻，表現出了良好的相容性。F至I 4組薄膜出現較多褶皺、已有部分團聚及氣孔現象，尤其在F與I組較為明顯。當茴香酸與兒茶素的添加量達到5%以上時，隨著添加量的增大以及混合時可能的不均勻導致出現略微的團聚，影響了薄膜的氫鍵作用。這也與抑菌薄膜的力學性能與阻隔性能的變化規(guī)律一致。

圖2 各組薄膜微觀截面圖Fig 2 Microscopic cross-sectional view of each group of films

2.3 力學性能

表3為各組薄膜的力學性能。隨著茴香酸與兒茶素含量的增加，薄膜的拉伸強度逐步下降，斷裂伸長率呈先上升后下降。與CK組相比，A到C 3組抑菌薄膜的拉伸強度均增加了68%左右，D至H組拉伸強度提高了31%左右，I組與CK組基本持平。在A組薄膜的拉伸強度達到最大，為25.57 MPa；在B組薄膜的斷裂伸長率達到最大為622.35%。這是由于茴香酸與兒茶素等小分子滲透在薄膜的非結晶區(qū)，增強了分子間作用力，促進了樹脂的結晶，使得薄膜具有較強的力學性能，表明了茴香酸和兒茶素與PP樹脂具有良好的相容性。9組薄膜的拉伸強度均大于CK組，斷裂伸長率從D組開始下降明顯，低于CK組。從D組往上，茴香酸與兒茶素的添加量>4%，其滲透到了薄膜結晶區(qū)，分子間的接觸率增加，分子間范德華力增大，導致薄膜的結構穩(wěn)定性受到一定的影響，使得樹脂分子的柔性略微降低。

表3 各組薄膜的力學性能Table 3 Mechanical properties of each group of films

a、b、c、d、e、f 行間不同的上標字母表示結果之間存在顯著差異(p <0.05)(方差分析)。

2.4 阻隔性能

氧氣與水蒸氣是微生物生長繁殖的必備條件，這就對薄膜的阻隔性能提出了較高的要求。薄膜的阻隔性能如表4所示，各組薄膜的氧氣與水蒸氣透過率較CK組均呈現一個先降低后上升的趨勢，其中A組薄膜的阻隔性能最佳，相比CK組、氧氣與水蒸氣透過率分別下降了42%與47%；之后B到E組均低于CK組，F到I組均略大于CK組。當加入的抑菌劑在4%以下時，抑菌劑的加入使得PP樹脂的分子間間隔被進一步填充，分子間作用力得到增強，薄膜空間網狀結構逐步致密，薄膜的阻隔性得到提升。當抑菌劑含量進一步加大時，薄膜分子間流動性受阻，不可避免的一些小團聚現象使得薄膜在微觀上出現細微的空洞，使薄膜的阻隔性能降低。

表4 各組薄膜的阻隔性能Table 4 Barrier performance of each group of films

2.5 MIC與MBC的測定

利用二倍稀釋法對兩種植物提取物的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度進行檢測，其結果如下表所示。最小抑菌濃度數值越低表明該抑菌劑對該菌的抑制效果越明顯，其中茴香酸對兩種指示菌的MIC分別為9.37、6.25 g/L；兒茶素對兩種指示菌的MIC分別為6.25、12.50 g/L。兩種植物提取物均對這兩種指示菌表現出抑制效果，對大腸桿菌的抑制強弱為兒茶素>茴香酸，對黑霉菌的抑制效果為茴香酸>兒茶素。與單一的抑菌劑相比，當兩種提取物共同作用時對大腸桿菌的MIC降低了40%,對黑霉菌的MIC降低了66.7%，對兩種菌的MBC也降低了50%左右。對兩種菌展現出了良好的協(xié)同抑制作用，得到更好的抑制效果。

表5 不同植物提取物對兩種菌的最小抑制濃度與最小殺菌濃度

2.6 抑菌薄膜對大腸桿菌抑制效果測定

各組抑菌薄膜對大腸桿菌的抑制效果如圖3所示，從圖整體上可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增長，各組抑菌薄膜的OD值整體上的差異性不是很明顯，除了I組與CK組(純PP薄膜)。其中I組抑菌薄膜在各個時間段的OD值均為最低，相比于CK組薄膜在24 h時OD值下降了約30%，展現出了較好的抑菌性。其次為F組與H組薄膜，兩組薄膜所添加的植物提取物的總體比例一致，F組薄膜兒茶素含量多1%、H組茴香酸含量多1%，兩組薄膜整體抑菌趨勢一致，24 h時F組OD值略低于H組，表明兒茶素對大腸桿菌的敏感性略強于茴香酸，這與最小抑菌濃度的測試相一致。這是由于各組抑菌薄膜在大腸桿菌生長繁殖的過程中不斷向外釋放抑菌物質，分散到菌液內，透過菌體細胞，在細胞內解離使內環(huán)境發(fā)生紊亂，并且能與細胞膜相結合使細菌細胞內容物外泄，導致細菌生長繁殖受到抑制[34]。相比于F、H、I三組，其他組薄膜的抑菌效果相對較弱，這與其所添加的提取物的含量相關，在薄膜中較為分散，使抑菌效果受到影響。

圖3 抑菌薄膜對大腸桿菌的抑制作用Fig 3 The inhibitory effect of antibacterial film on Escherichia coli

2.7 抑菌薄膜對黑曲霉抑制效果測定

各組抑菌薄膜對黑曲霉的抑制效果如圖4所示，從圖整體上可以看出，曲線整體上呈S型，在前56 h菌種生長繁殖迅速，56 h之后趨于平緩。從最終菌體干重來看大體分為3組：一組為A、B、D、E、G組薄膜，此組與CK組薄膜大體數值接近，對黑曲霉的抑制效果一般；二組為C、F、H組薄膜，此組薄膜相比于CK組抑制效果較為明顯，且均茴香酸的含量較高，表明茴香酸對黑曲霉的敏感性較強；最后一組為I組，此組薄膜的抑菌效果最好，在各個時段的菌體干重均為最低，相對于CK組，在72 h時的菌體干重減少了48%。這是由于各組抑菌薄膜在黑曲霉生長繁殖的過程中不斷向外釋放抑菌物質，擴散到菌液內，使得菌體的膜電位發(fā)生改變，增加了細胞膜通透性，并且能與孢子相結合使相關酶的活性受到抑制，導致黑曲霉的生長繁殖受到抑制[35]。

圖4 抑菌薄膜對黑曲霉的抑制作用Fig 4 The inhibitory effect of antibacterial film on Aspergillus Niger

2.8 薄膜抑菌圈測試

各組薄膜的抑菌圈大小如圖5所示。從圖中可以看出，CK組(純PP薄膜)對兩種菌均沒有抑制作用，抑菌圈均為0。A至C、D至F、G至I每3組的兩種菌的抑菌圈均呈現上升趨勢，且在相同茴香酸添加量的前提下，隨著兒茶素含量的增加，對大腸桿菌的抑制作用提升較快，相鄰組最高提升了32.8%，對黑霉菌的抑制效果相鄰組最高提升了22.9%。在不組別中，添加了相同兒茶素的組隨著茴香酸含量的增加，對黑霉菌的抑制效果提升較快，抑制效果最高提升了31%，對大腸桿菌的抑制效果最高提升了27.4%。其中I組薄膜對兩種菌的抑制效果最好，對大腸桿菌和黑霉菌的抑菌圈分別為20.31、21.55 mm?？傮w上兩種植物提取物均對兩種菌都有一定的抑制效果，其復合作用時，表現出了良好的協(xié)同作用。

圖5 各組薄膜抑菌圈Fig 5 Inhibition zone of each group of film

2.9 薄膜抑菌時效性測試

下表為各組薄膜在不同時間段下的抑菌效果的正交表，從表中可以看出，影響薄膜抑菌效果的因素依次為茴香酸含量(A)>兒茶素含量(B)>時間(C)。從K值中可以看出，抑菌效果最優(yōu)的工藝組合為A3B3C1,即茴香酸含量3%，兒茶素含量3%，時間為1 d，對此最優(yōu)組進行單獨驗證，其菌落數明顯低于對照組，抑菌率達到100%。由方差分析表中可知，因素A茴香酸含量、B兒茶素含量對抑菌結果有顯著性影響(P<0.05)。時間對薄膜的抑菌效果沒有顯著性影響。薄膜在放置1天后，H組薄膜的抑菌效果最好，抑菌率達到了88.3%，在放置4天后，G組薄膜的抑菌率最高為79.2%，一周后，I組薄膜抑菌率最高為93.1%。由此可見薄膜的抑菌效果并未隨著時間的延長而降低，隨著時間的增加，茴香酸與兒茶素通過微孔逐步向無菌瓶中釋放，在薄膜中顯示了一定的緩釋效果，展現出了一定的抑菌持續(xù)性。

表6 不同抑菌薄膜在不同時間下的抑菌效果正交優(yōu)化結果

方差來源Ⅲ類平方和自由度均方F顯著性A366.0062183.00374.530.013B221.5372110.76945.1120.022C17.53428.7673.5710.219誤差4.91122.455

3 結 論

(1)通過將茴香酸與兒茶素的共同加入，有效提升了聚丙烯薄膜的抑菌性能，兩種提取物表現出了良好的協(xié)同作用，隨著茴香酸與兒茶素的含量的增加，抑菌效果越明顯。

(2)茴香酸與兒茶素在制膜過程中沒有發(fā)生熱解與反應，并能夠很好地與樹脂共混，沒有使薄膜出現大量空隙與團聚現象。薄膜的力學性能與阻隔性能均較對照組純PP薄膜沒發(fā)生較大改變，滿足基本使用要求。

(3)從正交實驗結果看，各組薄膜在不同時間下均展現出了良好的抑菌抑菌持續(xù)性。但對其機理以及茴香酸與兒茶素在聚丙烯薄膜中的緩釋規(guī)律的研究較少，需進一步借助數學模型精確評估其活性物質釋放的濃度模式。