陳慧慧 黃麗麗

新生兒缺氧缺血性腦病在臨床上較為高發(fā)，極易引起新生兒智能發(fā)育障礙、癲癇、腦性癱瘓甚至死亡，嚴重危害其中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和生命健康安全［1］?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）是人體常見的一種金屬蛋白酶，可對腦血管外基膜相關(guān)主要成分、降解細胞外基質(zhì)成分進行攻擊，進而損害血腦屏障的完整性，導致血腦屏障通透性增加，而使用P38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen activated protein kinase，P38 MAPK）特異抑制劑可明顯減輕腦組織含水量［2-3］。P38MAPK信號傳導主要參與腦部缺氧缺血后的炎癥反應、腦細胞的增殖與分化、氧化應激等過程。阻斷P38MAPK信號在大腦缺血再灌注中的過度激活，下調(diào)MMP-9過表達，可減輕急性腦梗死腦水腫癥狀［4］。本研究旨在觀察P38MAPK 信號傳導通路在大鼠缺血再灌注中對MMP-9蛋白表達的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物及試劑 清潔級雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量200～250（228.17±14.22）g，購自北京動物實驗研究中心，動物使用許可證號：SYXK（京）2018-0013，于本院生物研究實驗中心進行實驗，在自然光照、相對濕度（64%±4%）、（21±4）℃室溫下進食3天。免疫組化試劑盒購自上海容暉生物科技有限公司，兔抗大鼠P38MAPK多克隆抗體、P-P38多克隆抗體及MMP-9抗體均購自上海西唐生物科技有限公司，P38特異抑制劑購自北京伊塔生物科技有限公司，ELISA試劑盒、BCA試劑盒等購自上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司，線栓（直徑：0.26 mm）購自廣州佳靈生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法 （1）線栓制備：線栓切為3 cm小段，于5、10、15、20 mm處進行標記，便于實驗中觀察；取砂布打磨線成圓頭形狀，置于石蠟中融化，將打磨好約5 mm長度的魚線插入石蠟中，3 s內(nèi)取出，待晾干后備用。（2）建模及分組：采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠取仰臥位，常規(guī)備皮消毒，于大鼠頸部中央位置切開，鈍性游離左頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，結(jié)扎頸部動脈的遠端分支，沿著手術(shù)線對大鼠頸內(nèi)動脈的顱外分支翼進行結(jié)扎，暫時夾閉左側(cè)頸總動脈血管，并在其頸外動脈結(jié)扎位置近端行約0.2 mm的切口，之后導入制備好的線栓；沿著頸外動脈分叉部位的動脈血管輕輕推進線栓，直至線栓抵達標注的20 mm位置，遇到阻力即停止推進；一旦線栓到達頸外動脈的起始位置，便結(jié)扎其頸外動脈近心端動脈血管，松開頸內(nèi)動脈血管夾，將多余的線栓剪除，其余線栓埋于大鼠皮下；最后，縫合切口并消毒。在大鼠動脈血管阻塞2 h后抽出線栓，將動脈血管阻塞端退出至分叉處，再次形成灌注后處死大鼠，取出大鼠腦部組織。根據(jù)大鼠大腦動脈阻斷的不同模型分為對照組、缺血再灌注組和P38抑制劑組，每組各30例。其中，缺血再灌注組在制備SD大鼠腦動脈缺血再灌注模型前15 min，通過舌下靜脈注射二甲基亞砜（南通英瑞達生物科技有限公司）400μg/kg；P38抑制劑組在制備SD大鼠腦動脈缺血再灌注模型前15 min，舌下靜脈注射P38抑制劑（上海潤諾生物科技有限公司）400μg/kg；對照組，切開大鼠皮膚，游離至大鼠動脈分叉處，未做插線處理，即刻縫合切口。三組均于手術(shù)24 h處死大鼠，取出腦部組織備用。（3）大鼠腦組織含水量測定：采用干濕質(zhì)量法檢測各組腦動脈缺血再灌注大鼠的腦組織含水量，腦組織含水量=（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%［5］。（4）腦梗死體積測定：采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色法，切取大鼠冠狀腦片（間距2 mm），置于1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液，避光染色30 min，之后置于多聚甲醛PBS溶液中固定保存；觀察三組大鼠腦組織的染色情況，紅色為正常腦組織，白色為梗死腦組織，拍照并計算腦梗死面積。（5）P38MAPK、MMP-9蛋白表達檢測：采用免疫組織化學染色法，嚴格按照試劑盒說明要求操作，顯微鏡下觀察細胞內(nèi)P38MAPK、MMP-9蛋白的陽性表達情況。P38MAPK陽性，棕、黃褐色顆粒狀；MMP-9陽性，棕黃色顆粒狀；正常細胞染色為綠色［6］。

1.3 觀察指標 三組大鼠的腦組織含水量、梗死體積及P38MAPK、MMP-9蛋白表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以［n（%）］表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠的腦組織含水量及梗死體積比較 缺血再灌注組大鼠的腦組織含水量及梗死體積均明顯高于P38抑制劑組、對照組（P<0.05），P38抑制劑組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 三組大鼠的腦組織含水量及梗死體積比較［n=30，（±s）］

表1 三組大鼠的腦組織含水量及梗死體積比較［n=30，（±s）］

組別 腦組織含水量（%） 梗死體積（mm3）對照組 0 0缺血再灌注組 87.91±0.08 68.23±8.25 P38抑制劑組 68.59±0.13 39.69±6.30

2.2 三組大鼠的P38MAPK、MMP-9蛋白表達情況比較 缺血再灌注組大鼠的P38MAPK、MMP-9蛋白表達均明顯高于P38抑制劑組、對照組，且P38抑制劑組P38MAPK、MMP-9蛋白表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2和圖1-2。

表2 三組大鼠的P38MAPK、MMP-9蛋白表達情況比較［n=30，（±s）］

表2 三組大鼠的P38MAPK、MMP-9蛋白表達情況比較［n=30，（±s）］

組別 P38MAPK MMP-9對照組 2.72±0.73 18.83±5.91缺血再灌注組 10.45±2.76 59.05±6.59 P38抑制劑組 7.85±1.61 31.78±7.46

圖1 缺血再灌注大鼠腦組織P38MAPK的表達（免疫組化法×400）

圖2 缺血再灌注大鼠腦組織皮層區(qū)MMP-9的表達（免疫組化法×400）

3 討論

大腦一旦發(fā)生缺氧缺血，腦部神經(jīng)細胞會快速凋亡，導致神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，誘發(fā)缺血缺氧性腦損傷［7］。新生兒缺血缺氧性腦損傷受多種因素共同影響，會造成大腦組織后期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，甚至導致死亡［8］。臨床上尚無針對缺氧缺血性腦損傷的有效干預措施，需要積極關(guān)注并預防。缺血再灌注時，通常會伴隨大量黏附分子的過表達，特別是基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的代謝產(chǎn)物，嚴重破壞腦毛細血管基底層，導致大鼠血腦屏障通透性遭到直接破壞［7-10］。腦組織中MMP-9屬于明膠酶的一種類型，主要由血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞、海馬神經(jīng)元及小膠質(zhì)細胞等分泌，在缺血缺氧性腦損傷病理情況下表達增高，細胞基質(zhì)成分降解后極易破壞血腦屏障的完整性及通透性，引發(fā)并加重腦水腫癥狀［11］。P38MAPK是MAPK家族控制炎癥反應最重要的成員，該信號通路會誘導大鼠血腦屏障通透性及腦含水量降低，大鼠缺血周邊區(qū)腦組織MMP-9的表達明顯下調(diào)［12-13］。

本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注組大鼠腦組織含水量、梗死體積均明顯高于P38抑制劑組和對照組，且P38抑制劑組高于對照組，提示P38MAPK信號通路會加重SD大鼠缺血再灌注后腦水腫的發(fā)生風險，阻斷P38MAPK通路能夠明顯降低腦動脈缺血再灌注大鼠血腦屏障破壞、創(chuàng)傷性腦水腫以及腦梗死體積，提高腦缺血再灌注損傷的臨床療效［14］。究其原因，發(fā)現(xiàn)P38MAPK參與了大鼠腦缺血再灌注后腦水腫的形成，機制可能為大鼠缺血再灌注后激活P38MAPK使缺血周邊區(qū)腦組織MMP-9的表達上調(diào)，破壞血腦屏障通透性，進而導致了腦動脈缺血再灌注大鼠腦水腫癥狀的發(fā)生［15-16］。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注組P38MAPK蛋白、MMP-9蛋白表達均明顯高于P38抑制劑組和對照組，且P38抑制劑組P38MAPK蛋白、MMP-9蛋白表達高于對照組，說明抑制P38MAPK信號通路會明顯降低腦動脈缺血再灌注大鼠P38MAPK蛋白、MMP-9蛋白水平，將因缺血再灌注所造成的血腦屏障損傷降低到最低限度，抑制缺血中心區(qū)神經(jīng)元的興奮性，通過對缺血缺氧性SD大鼠相關(guān)神經(jīng)小膠質(zhì)細胞的活性進行調(diào)節(jié)，緩解腦白質(zhì)損傷，改善大鼠血腦屏障的通透性［17］。同時，抑制P38MAPK信號通路可對腦部黃嘌呤氧化酶、次黃嘌呤氧化酶相關(guān)活性通路進行抑制，減少腦部氧自由基含量，確保血腦屏障完整性穩(wěn)定，進一步緩解腦水腫，保護大鼠腦神經(jīng)細胞［18］。

綜上所述，P38MAPK信號通路通過MMP-9的表達致使血腦屏障損傷，進而加重SD大鼠缺血再灌注后腦水腫的發(fā)生風險，阻斷P38MAPK通路可下調(diào)大鼠創(chuàng)傷后MMP-9高表達，減輕血腦屏障破壞及創(chuàng)傷性腦水腫。