李露露 徐素美

衰老是機(jī)體細(xì)胞、組織的機(jī)能和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的退行性變化，是生命發(fā)展的必然規(guī)律［1-2］，與高血壓、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化以及老年癡呆等許多疾病互為因果［3］。隨著人口老齡化加劇，至2050年全球60歲以上的老年人口數(shù)將占據(jù)人口總數(shù)的22%［4］。D-半乳糖被廣泛用于衰老模型的構(gòu)建［5］，高劑量D-半乳糖氧化可產(chǎn)生過(guò)氧化氫和醛糖，可進(jìn)一步形成自由基和超氧陰離子加速細(xì)胞凋亡［6-7］，使機(jī)體出現(xiàn)多種功能減退等現(xiàn)象。多糖抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等作用的機(jī)制未完全闡明［8］。本研究旨在觀察紅豆杉多糖對(duì)D-半乳糖所造的衰老模型小鼠肝功能的影響，并初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只雄性SPF級(jí)ICR小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由南京大學(xué)模式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（蘇）2015-0001。每籠4只分籠飼養(yǎng)，室溫（24±2）℃，濕度50%～70%，光暗周期12 h/12 h，自由飲食飲水。

1.2 儀器及試劑 渦旋混合器（型號(hào)：WH-861，華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（型號(hào)：JYD-650，上海之信儀器），全自動(dòng)生化儀（型號(hào)：AU480），低速離心機(jī)（型號(hào)：X12R，德國(guó)貝克曼公司），SpectraMax Plus384多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司），自動(dòng)包埋機(jī)（型號(hào)：EC-350-1，德國(guó)MICROM有限公司），石蠟切片機(jī)（型號(hào)：HM 315，德國(guó)MICROM有限公司）。D-半乳糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），紅豆杉多糖（紅豆多糖含量：92.88%，分子量：59.2 Ku，單糖組成：甘露糖：葡萄糖：阿拉伯糖：半乳糖：鼠李糖=1∶1∶6∶4∶4，浙江省中醫(yī)藥研究院），多烯磷脂酰膽堿膠囊（易善復(fù)，賽諾菲制藥有限公司），丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒（WST-1法）（南京建成生物工程研究所），總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）（上海億日科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）分組：ICR小鼠根據(jù)SPSS 21.0提供的隨機(jī)數(shù)字分為6組，空白組、D-半乳糖模型組、陽(yáng)性藥物組（易善復(fù)）、紅豆杉多糖低劑量組（200 mg·kg-1）、紅豆杉多糖中劑量組（400 mg·kg-1）、紅豆杉多糖高劑量組（800 mg·kg-1）組。（2）造模：除空白對(duì)照組，其余各組均給予頸部皮下注射D-半乳糖100 mg·kg-1，共8周。（3）干預(yù)：造模第4周起，空白對(duì)照組及D-半乳糖模型組分別給予NS 10 mL·kg-1灌胃，1次/天，連續(xù)4周；紅豆杉多糖高/中/低劑量組分別給予由生理鹽水配置的20 mg·mL-1、40 mg·mL-1、80 mg·mL-1紅豆杉多糖水溶液灌胃10 mL·kg-1，1次/天，連續(xù)4周。（4）血清ALT、AST含量檢測(cè)：造模第8周結(jié)束時(shí)，利用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠血清AST、ALT水平。（5）肝組織勻漿中SOD活性、MDA含量、T-AOC測(cè)定：隨機(jī)挑選10只小鼠，準(zhǔn)確稱(chēng)取肝組織重量，按照肝組織重量（g）與NS體積（mL）為1∶9的比例加相應(yīng)體積的NS，剪碎組織，冰水浴，肝組織勻漿經(jīng)3,000 r/min離心10 min，取上清液，制備得到10%肝組織勻漿。利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠肝組織勻漿總抗氧化能力（T-AOC）。比色法檢測(cè)SOD活性及MDA含量。（6）小鼠肝臟HE染色：每組隨機(jī)挑選5只小鼠，水合氯醛麻醉后，開(kāi)胸暴露心臟，5%福爾馬林灌注，取肝組織，放置4%多聚甲醛溶液中固定，按照濃度梯度進(jìn)行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，切片脫蠟至水，HE染色后觀察肝組織變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)8周后各組小鼠的一般情況 空白組小鼠皮膚較緊實(shí)，活動(dòng)能力可；D-半乳糖模型組小鼠皮膚比較松弛，易激惹，活動(dòng)度差；紅豆杉多糖低/中/高劑量組和陽(yáng)性藥物組小鼠的精神狀態(tài)可，皮膚松弛程度較模型組程度輕，活動(dòng)度良好。

2.2 各組小鼠血清ALT、AST水平比較 與空白對(duì)照組比較，D-半乳糖模型組小鼠血清ALT、AST含量顯著升高（P<0.01）。與D-半乳糖模型組比較，紅豆杉多糖低/中/高劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠血清ALT、AST含量均顯著降低（P<0.01）。肝功能改善程度與紅豆杉多糖劑量無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較 ［n=15，（±s）］

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較 ［n=15，（±s）］

注：與空白對(duì)照組比較，△P<0.01；與D-半乳糖模型組比較，*P<0.01

組別 ALT（U·L-1） AST（U·L-1）空白對(duì)照組 30.50±6.63 38.50±6.21 D-半乳糖模型組 41.00±16.67△ 81.57±17.18△陽(yáng)性藥物組 21.29±7.87* 53.86±21.64*紅豆杉多糖低劑量組 20.29±4.15* 48.86±10.04*紅豆杉多糖中劑量組 20.50±8.43* 48.43±10.89*紅豆杉多糖高劑量組 19.88±8.17* 55.38±14.15*

2.3 各組小鼠肝臟組織勻漿SOD活性及MDA含量比較 與空白對(duì)照組比較，D-半乳糖模型組小鼠肝臟組織勻漿中SOD的活性降低、MDA含量升高（P<0.01）。與D-半乳糖模型組比較，紅豆杉多糖低/中/高劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠肝組織勻漿中SOD活性均提高、MDA含量均降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肝臟組織勻漿SOD活性及MDA含量比較［n=15，（±s）］

表2 各組小鼠肝臟組織勻漿SOD活性及MDA含量比較［n=15，（±s）］

注：與空白對(duì)照組比較，△P<0.01；與D-半乳糖模型組比較，#P<0.01，*P<0.05

組別 SOD活力（U·mgprot-1） MDA含量（nmol·mgprot-1）空白對(duì)照組 95.14±36.32 1.44±0.47 D-半乳糖模型組 61.01±17.52△ 2.15±0.41△陽(yáng)性藥物組 89.31±19.11* 1.44±0.53#紅豆杉多糖低劑量組 96.73±40.66# 1.44±0.41#紅豆杉多糖中劑量組 94.39±25.33# 1.48±0.48#紅豆杉多糖高劑量組 87.70±29.42* 1.27±0.45#

2.4 各組小鼠肝組織勻漿的T-AOC比較 D-半乳糖模型組的T-AOC顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05），陽(yáng)性藥物組及紅豆杉多糖低/中/高劑量組的T-AOC均高于D-半乳糖模型組（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肝組織勻漿的T-AOC比較［n=15，（±s）］

表3 各組小鼠肝組織勻漿的T-AOC比較［n=15，（±s）］

注：與空白對(duì)照組比較，△P<0.01；與D-半乳糖模型組比較，#P<0.01，*P<0.05

組別 T-AOC（U/mL）空白對(duì)照組 0.1715±0.0465 D-半乳糖模型組 0.1157±0.0278△陽(yáng)性藥物組 0.1720±0.0305#紅豆杉多糖低劑量組 0.1750±0.0539*紅豆杉多糖中劑量組 0.1745±0.0420*紅豆杉多糖高劑量組 0.1773±0.0488*

2.5 各組小鼠肝組織病理組織變化 空白組小鼠鏡下肝細(xì)胞排列整齊、緊密，小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯脂肪變性，血管周?chē)鸁o(wú)明顯炎癥浸潤(rùn)；D-半乳糖模型組肝細(xì)胞排列稀疏，雜亂，細(xì)胞界線不清，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量的脂肪變性；紅豆杉多糖低/中/高劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠的肝臟組織可見(jiàn)細(xì)胞排列尚整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)存在，血管周?chē)鸁o(wú)明顯炎癥浸潤(rùn)，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性程度輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肝組織病理結(jié)果（HE×200）

3 討論

機(jī)體的抗氧化防御與自身產(chǎn)生的自由基在正常生理?xiàng)l件下可維持相對(duì)平衡，機(jī)體在衰老過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，當(dāng)體內(nèi)自由基失衡時(shí)，可引起衰老、疾病等。人體內(nèi)的自由基主要是氧自由基，對(duì)不飽和共價(jià)鍵有特殊親和力，能使脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生丙二醛進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使DNA分子解聚進(jìn)而破壞細(xì)胞內(nèi)線粒體導(dǎo)致細(xì)胞自溶。機(jī)體內(nèi)還有許多抗氧化酶系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等［9-10］。自由基可破壞肝細(xì)胞膜、DNA及線粒體，從而引起肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白合成異常以及能量失衡，從而誘發(fā)肝細(xì)胞壞死，激活庫(kù)普弗細(xì)胞導(dǎo)致肝細(xì)胞纖維化［11-12］。研究表明，適量的D-半乳糖在代謝過(guò)程可通過(guò)轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟沁M(jìn)而參與糖代謝過(guò)程，但過(guò)量D-半乳糖的攝入可生成大量的超氧陰離子和多種氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損害，進(jìn)一步引起機(jī)體多臟器、多系統(tǒng)功能減退，最終引發(fā)衰老。D-半乳糖建模利用廣泛，造模時(shí)間短，成模率較高，模型穩(wěn)定［13-15］。

植物多糖具有廣泛的藥理學(xué)作用，在體內(nèi)發(fā)揮的生物活性與其結(jié)構(gòu)和被消化、酵解、吸收的過(guò)程有關(guān)，多是在經(jīng)過(guò)消化酵解被吸收后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用［16］。紅豆杉為世界瀕危珍稀植物，其樹(shù)皮是著名抗癌物質(zhì)紫杉醇的提取原材料。紅豆杉屬植物含有多種其他類(lèi)型的化學(xué)成分，主要包括黃酮類(lèi)、木脂素類(lèi)、甾體類(lèi)、酚酸類(lèi)、倍半萜及多糖類(lèi)化合物等［17］。紅豆杉多糖是利用極性梯度提取技術(shù)在南方紅豆杉枝葉中提純發(fā)現(xiàn)的一種全新的多糖［18］，具有抗腫瘤、防治心肌梗死、抗糖尿病、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能等作用［19-24］。本研究結(jié)果表明，紅豆杉多糖可升高衰老模型小鼠肝組織均漿中的SOD活力、T-AOC，降低小鼠肝組織均漿中MDA含量，改善小鼠血清ALT、AST含量，提示其可能通過(guò)提高抗氧化損害從而發(fā)揮改善衰老模型小鼠肝功能的作用，并且無(wú)明顯量效關(guān)系?；诖耍菊n題組將進(jìn)一步建立體外模型來(lái)探討紅豆杉多糖保護(hù)衰老模型肝功能作用的具體靶點(diǎn)，為紅豆杉多糖的藥效評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支撐。