顧健坤 馬偉斌 姚明 周超瑞 陳國慧

乳腺癌的不良預(yù)后主要?dú)w因于乳腺癌細(xì)胞的高度復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，進(jìn)行相關(guān)的機(jī)制研究對提高乳腺癌患者的生存率至關(guān)重要［1-2］。凋亡是程序性的細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)凋亡已被評(píng)估為處置癌細(xì)胞最有前途的方法。Bcl-2家族成員主要位于線粒體膜上，并與線粒體膜電位損失和細(xì)胞色素c釋放密切相關(guān)。促細(xì)胞分裂劑活化蛋白激酶（MAPK）的活化參與細(xì)胞凋亡［3］，主要通過ERK1/2（p44/p42）、c-Jun氨基末端激酶JNK（p46/p54）和p38激酶三種途徑。ERK1/2（p44/p42）主要被有絲分裂刺激激活，導(dǎo)致細(xì)胞生長和存活的生長因子；JNK和p38被DNA損傷，氫激活過氧化物，細(xì)胞表面受體Fas，紫外線照射，熱滲透休克，化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)導(dǎo)致凋亡的細(xì)胞死亡［4-5］。右美托咪定是一種具有止痛、鎮(zhèn)靜和血液動(dòng)力學(xué)作用的親脂性α2腎上腺素能激動(dòng)劑，已廣泛用于減輕應(yīng)激反應(yīng)和全身性炎癥、抗焦慮、維持心血管系統(tǒng)的正常功能［6］。研究表明，嗎啡和丙泊酚等麻醉劑可能會(huì)影響惡性實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7］。本研究主要探討右美托咪定對人乳腺癌SKBR-3細(xì)胞株MAPK/JNK/Bcl-2信號(hào)通路及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀 器 及 試 劑 RPMI-1640培 養(yǎng) 基（Gibco，Invitrogen，5412）、胎牛血清（Gibco，Invitrogen，6541）、TRIzol試劑（Gibco，Invitrogen，63654）、青霉素（碧云天生物技術(shù)有限公司，36541）、鏈霉素（碧云天生物技術(shù)有限公司，2651）、裂解緩沖液（碧云天生物技術(shù)研究所，P0013）、二甲基亞砜（碧云天生物技術(shù)有限公司，6325）、BCA蛋白質(zhì)試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司，5489）、Biotek Elx-800讀板儀（美國賽默飛世爾科技公司）、化學(xué)發(fā)光底物顯影（Thermo Fisher，美國賽默飛世爾科技公司）、3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）試劑（Sigma Chemical Co，36541）、Giemsa溶液（sigma，62556）、SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（sigma，3246）、SDS-PAGE膜（sigma，45874）、抗MAPK、JNK、Bcl-2（1∶1,000；Cell Signaling Technology Inc，65478、58774、24785）、辣根過氧化物酶二抗的山羊抗兔IgG（1∶1,000；Santa Cruz Biotechnology，USA，36574）、Annexin V試劑盒（美國Becton Dickinson公司，21546）、BD FACS Aria II流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）、計(jì)算機(jī)輔助圖像分析儀（Olympus Microimage?圖像分析，美國Windows 4.0版軟件）、PrimeScript RT試劑盒（TakaraBio，69584）、半干轉(zhuǎn)移裝置（伯樂公司Bio-Rad，中國上海）、Molecular Imager Chemidoc XRS System（伯樂公司Bio-Rad，中國上海）、iQTM Green Supermix iQ5實(shí)時(shí)檢測系統(tǒng)（伯樂公司Bio-Rad Laboratories，美國）、聚偏二氟乙烯膜（密理博公司Millipore，69658）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：人乳腺癌SKBR-3細(xì)胞株細(xì)胞獲自西安空軍軍醫(yī)大學(xué)，在帶濕度培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2、2% O2、93%N2）和含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（2）分組：①SKBR-3細(xì)胞組：細(xì)胞濃度為5×106/mL的乳腺癌SKBR-3細(xì)胞液在10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；②順鉑組：乳腺癌SKBR-3細(xì)胞培養(yǎng)方法同前，在培養(yǎng)基中加入順鉑100.0 μg/mL［8］；③右美托咪定低、高劑量組：乳腺癌SKBR-3細(xì)胞培養(yǎng)方法同前，分別加入右美托咪定100.0 μg/mL、200.0 μg/mL［9］。以上各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣，培養(yǎng)72 h。

1.3 細(xì)胞增殖及克隆形成數(shù)目測定 （1）細(xì)胞活力測定：使用MTT測定法，將細(xì)胞接種在96孔聚苯乙烯培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%（v/v）的CO2中溫育24 h，然后從每個(gè)孔中除去100 μL培養(yǎng)基，并將100 μL不同濃度的ISO加入細(xì)胞中并溫育24 h、48 h。再將溶解于磷酸鹽緩沖鹽水中的100 μL 0.5%（w/v）MTT加入每個(gè)孔中，并孵育4 h，之后向每個(gè)孔中加入100 μLDMSO。使用Biotek Elx-800酶標(biāo)儀（中國Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室有限公司）測量490 nm處的吸光度。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD）/（實(shí)驗(yàn)組OD-SKBR-3細(xì)胞組OD）。（2）克隆形成數(shù)目測定：各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞接種在6孔板中，50/孔，37 ℃下孵育14天，PBS洗滌3次，Giemsa溶液染色細(xì)胞，從7個(gè)隨機(jī)視野計(jì)算克隆形成數(shù)目。

1.4 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移水平測定 傷口愈合測試細(xì)胞侵襲，將乳腺癌SKBR-3細(xì)胞分別接種在多孔板上，并在含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至達(dá)到匯合為止，然后使用移液器吸頭（100 μL）閉合傷口。在測試開始時(shí)和細(xì)胞遷移2 h、4 h、6 h后捕獲圖像，比較圖像以量化細(xì)胞的遷移速率。

1.5 細(xì)胞凋亡水平測定 采用Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）雙重染色。所有乳腺癌SKBR-3細(xì)胞使用Annexin V試劑盒進(jìn)行染色，1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞具有暴露的磷脂酰絲氨酸，但完整的細(xì)胞膜與膜聯(lián)蛋白V-FITC結(jié)合，但排除了PI；凋亡晚期的細(xì)胞均用膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI標(biāo)記，而壞死細(xì)胞僅用PI標(biāo)記。

1.6 細(xì)胞MAPK、JNK、Bcl-2基因水平測定 使用TRIzol試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離出總RNA 0.5 μg。使用PrimeScript RT試劑盒，用1μg總RNA合成第一鏈cDNA。應(yīng)用SYBR Green qPCR SuperMix-UDG試劑在實(shí)時(shí)定量PCR使用iQTM Green Supermix iQ5實(shí)時(shí)檢測系統(tǒng)進(jìn)行PCR。應(yīng)用比較循環(huán)閾值（Ct）方法通過計(jì)算2-ΔΔCt來量化基因表達(dá)水平。引物由上海生工科技合成，序列如下：MAPK，正向：5′-CGTGAGTGCCGCCCCCGTGA-3′，反向：5′-GTGTGACCCTGCTGTGCGTGACT-3′；JNK，正向：5′-TGTGACTGTGTCGGCAGCCCGTGACG-3′，反向：5′-CGTACTGCACGAATTCGTACTG-3′；Bcl-2，正向：5′-CCGTACTGACGTCGGCACCGTGAACTG-3′，反向：5′-GTGTGACGGCGAAGTGAC-3′。

1.7 細(xì)胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白水平測定 將細(xì)胞用PBS（pH 7.4）洗滌2次，并在含有1%PMSF和20 mM NaF的裂解緩沖液中在冰上裂解10 min，然后將其轉(zhuǎn)移至微量離心管中，將樣品在4 ℃下以15,000 g離心10 min，之后將上清液轉(zhuǎn)移至新試管中，使用BCA蛋白質(zhì)試劑盒測定總蛋白濃度。將從細(xì)胞制備的勻漿用SDS樣品緩沖液處理，并立即在95 ℃下加熱10 min。蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE膜分離后，使用半干轉(zhuǎn)移裝置電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，在TBST（20 mM Tris，166 mM NaCl和0.05%Tween 20，pH 7.5）中的5%脫脂奶粉中封閉2 h，然后將膜在臺(tái)式濃縮器中于室溫下以70 r/min洗滌15 min，該程序重復(fù)3遍后，將一抗以建議稀釋度在TBST緩沖液中于4 ℃過夜添加，之后在TBST中洗滌3次，再加入二抗并在25 ℃下孵育2 h。印跡再經(jīng)TBST洗滌3次，用化學(xué)發(fā)光底物顯影，并使用Molecular Imager Chemidoc XRS System曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組比較采用單方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的OD值、存活率比較 與SKBR-3細(xì)胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的OD值、存活率均降低（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的OD值、存活率升高（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的OD值、存活率降低（P<0.05）。見表1和圖1。

表1 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的OD值、存活率比較［n=6，（±s）］

表1 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的OD值、存活率比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細(xì)胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 OD值 存活率（%）SKBR-3細(xì)胞組 0μg /mL 0.87±0.08 90.32±2.63順鉑組 100.0μg /mL 0.32±0.07a 35.63±3.41a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 0.65±0.05ab 74.63±3.54ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 0.52±0.08abc 56.63±4.23abc

圖1 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞增殖水平比較（倒置顯微鏡×400）

2.2 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的克隆形成數(shù)目比較 與SKBR-3細(xì)胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的克隆形成數(shù)目降低（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的克隆形成數(shù)目升高（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的克隆形成數(shù)目降低（P<0.05）。見表2和圖2。

表2 子宮內(nèi)實(shí)性腫塊MRI表現(xiàn)

表2 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的克隆形成數(shù)目比較［n=6，（±s）］

表2 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的克隆形成數(shù)目比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細(xì)胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 克隆形成數(shù)目（個(gè)）SKBR-3細(xì)胞組 0μg /mL 1,265.63±26.63順鉑組 100.0μg /mL 325.63±41.63a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 741.63±26.36ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 541.36±23.69abc

圖2 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的克隆形成數(shù)目比較（Giemsa溶液染色×400）

2.3 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的侵襲遷移能力比較 與SKBR-3細(xì)胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組侵襲距離降低（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組侵襲距離升高（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組侵襲距離降低（P<0.05）。見表3和圖3。

圖3 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的穿膜數(shù)目比較（0.1%結(jié)晶紫染色×100）

表3 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞侵襲遷移能力的比較［n=6，（±s）］

表3 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞侵襲遷移能力的比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細(xì)胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 侵襲距離（um）SKBR-3細(xì)胞組 0μg /mL 396.63±33.84順鉑組 100.0μg /mL 90.19±26.48a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 159.48±54.96ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 123.48±18.87abc

2.4 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞凋亡率比較 與SKBR-3細(xì)胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的凋亡率升高（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的凋亡率降低（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的凋亡率升高（P<0.05）。見表4和圖4。

表4 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞凋亡率比較［n=6，（±s）］

表4 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞凋亡率比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細(xì)胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 凋亡率（%）SKBR-3細(xì)胞組 0μg /mL 5.18±0.14順鉑組 100.0μg /mL 36.40±2.27a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 19.00±2.24ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 46.50±2.14abc

圖4 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞凋亡率比較

2.5 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平比較 與SKBR-3細(xì)胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平升高（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05）。見表5。

表5 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平比較［n=6，（±s）］

表5 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細(xì)胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 MAPK JNK Bcl-2 SKBR-3細(xì)胞組 0μg /mL 5.78±0.18 5.36±0.29 6.21±0.20順鉑組 100.0μg /mL 1.45±0.21a 1.68±0.23a 2.12±0.23a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 4.56±0.24ab 4.01±0.16ab 4.21±0.19ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 3.02±0.26abc 3.14±0.19abc 3.10±0.16abc

2.6 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 與SKBR-3細(xì)胞組比較，順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。見表6和圖5。

圖5 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞MAPK、JNK蛋白表達(dá)水平的比較（電泳圖）

表6 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較［n=6，（±s）］

表6 各組乳腺癌SKBR-3細(xì)胞MAPK、JNK、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較［n=6，（±s）］

注：與SKBR-3細(xì)胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與右美托咪定低劑量組比較，cP<0.05

組別 劑量 MAPK JNK Bcl-2 SKBR-3細(xì)胞組 0μg /mL 6.47±0.19 6.43±0.24 6.24±0.23順鉑組 100.0μg /mL 1.19±0.16a 2.50±0.26a 1.96±0.32a右美托咪定低劑量組 100.0μg /mL 3.48±0.19ab 5.12±0.26ab 5.14±0.23ab右美托咪定高劑量組 200.0μg /mL 1.99±0.19abc 3.15±0.45abc 2.54±0.24abc

3 討論

乳腺癌是最常見的侵襲性腫瘤之一，是全世界女性癌癥死亡的主要原因，每年有近23萬例新病例和4萬例乳腺癌死亡。 乳腺癌的早期檢測、診斷方面雖取得了進(jìn)步，但外科手術(shù)以及放化療之后的復(fù)發(fā)率呈上升趨勢。因此，尋求乳腺癌新的治療藥物具有重要意義。

嗎啡、戊巴比妥、曲馬多、舒芬太尼和右旋等麻醉劑常被用于癌癥患者的手術(shù)中。研究表明，嗎啡皮下注射對于終末呼吸困難的患者非常有效；右美托咪定是一種α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，可用于減輕重癥監(jiān)護(hù)病房患者的全身炎癥和劇烈疼痛，改善機(jī)械通氣圍手術(shù)期患者的呼吸功能［10］；右美托咪定還具有輻射防護(hù)作用，可改善腦腫瘤的放射治療效果，可通過促進(jìn)肺細(xì)胞增殖對肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用，此外右美托咪定還能抑制小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲性增殖［11-12］。本研究結(jié)果顯示，與SKBR-3細(xì)胞組比較，右美托咪定低/高劑量組的OD值、存活率、單克隆形成水平、侵襲距離降低，而凋亡水平升高，說明右美托咪定能夠明顯抑制SKBR-3細(xì)胞株增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲，促進(jìn)其凋亡，右美托咪定的抗癌活性歸因于細(xì)胞黏附、增殖、存活、侵襲和細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)的信號(hào)通路的抑制［13］。與其他癌細(xì)胞不同，乳腺癌細(xì)胞SKBR-3不會(huì)通過間充質(zhì)或類動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)的活躍機(jī)制侵入，而是通過形成腫瘤栓子侵入，在3-D培養(yǎng)中形成球體，球體中的SKBR-3細(xì)胞保留了E-鈣黏著蛋白的細(xì)胞-細(xì)胞黏附力。研究表明，右美托咪定可明顯抑制癌細(xì)胞E-鈣黏著蛋白表達(dá)水平。

與SKBR-3細(xì)胞組比較，本研究順鉑組、右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低；與順鉑組比較，右美托咪定低/高劑量組的MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高；與右美托咪定低劑量組比較，右美托咪定高劑量組的MAPK、JNK、 Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低；說明右美托咪定能夠明顯抑制SKBR-3細(xì)胞MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平。MAPK涉及細(xì)胞生長、分化和凋亡等多種生理過程，絲氨酸/蘇氨酸激酶家族響應(yīng)于不同的細(xì)胞外刺激介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。MAPK是癌細(xì)胞生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需，MAPK的抑制在角鯊烯、紫杉醇、索拉非尼、洛伐他汀、和紫杉醇等各種抗癌刺激中被證實(shí)，抑制MAPK信號(hào)可以增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)人類肝癌細(xì)胞凋亡的能力［14-15］。線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑是固有的凋亡途徑，通過細(xì)胞色素C的釋放和隨后caspase-3的裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族成員是線粒體釋放細(xì)胞色素c的抑制調(diào)節(jié)劑，可以通過改變其構(gòu)象在線粒體外膜上形成線粒體通透性過渡孔（mPTP），使細(xì)胞色素C從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)［16］。細(xì)胞試驗(yàn)表明，丁酸可通過抑制人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞中的JNK激酶途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，JNK抑制Bcl-2的表達(dá)可促進(jìn)凋亡細(xì)胞中細(xì)胞色素c的釋放和caspase-3的活化。主要?dú)w因于JNK通過Bcl-2的磷酸化來解離Bcl-2/Bax復(fù)合物，最終促進(jìn)活性Bax從胞質(zhì)向線粒體區(qū)室的轉(zhuǎn)運(yùn)并誘導(dǎo)凋亡［17-18］。

綜上所述，右美托咪定能明顯抑制SKBR-3乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲，促進(jìn)其凋亡，與劑量呈正性相關(guān)，作用機(jī)制與明顯抑制SKBR-3細(xì)胞MAPK、JNK、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制MAPK/JNK/Bcl-2信號(hào)通路的激活有關(guān)。