姚夢雅， 劉 超， 孫兆瑞， 黃昌保， 張 煒， 楊志洲， 任 藝， 韓小琴， 聶時南

百草枯(paraquat, PQ)是一種高效、廣譜的除草劑，由于缺乏有效解毒藥，百草枯中毒患者救治難度大，病死率高。百草枯導(dǎo)致的肺損傷、肺纖維化是致死的主要原因，發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不明確，包括氧化應(yīng)激、炎癥風(fēng)暴等，涉及到的通路復(fù)雜包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)/Smad信號通路及MAPK通路等[1]。近年來，中藥復(fù)方和單體藥物在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用逐漸受到重視，在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者救治過程中也發(fā)揮了重要作用[2]。柚皮苷(naringin)是一種廣泛存在于各類植物和中藥中的二氫黃酮類化合物。已有研究[3-4]表明, 柚皮苷具有包括抗炎、抑制氧化應(yīng)激、抗腫瘤和抗纖維化等多種生物活性，但柚皮苷對急性肺損傷保護(hù)作用的相關(guān)研究報(bào)道較少，本文對此進(jìn)行研究，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑與藥品 柚皮苷，百草枯(Sigma)；羥脯氨酸(HYP)含量測定試劑盒(索萊寶)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定試劑盒，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定試劑盒(碧云天)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒(南京建成)，大鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA檢測試劑盒(碧云天)，qRT-PCR引物(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR相關(guān)試劑(Takara)。

1.2動物造模及分組 清潔級雄性SD大鼠30只(8～10周齡，體質(zhì)量200～220 g)由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。隨機(jī)分為三組：空白對照組、百草枯組與柚皮苷+百草枯組，每組各10只。百草枯組大鼠腹腔注射百草枯(20 mg/kg)；百草枯+柚皮苷組大鼠腹腔注射百草枯(20 mg/kg)，2 h后腹腔再注射柚皮苷(100 mg/kg)。實(shí)驗(yàn)方案得到東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2019JLHGKJDWLS-035)。

1.3肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)及HYP含量檢測 取左肺吸干表面液體，稱濕質(zhì)量，置于烘箱中晾干至恒重，稱干質(zhì)量，計(jì)算W/D。按試劑盒說明書采用微量法檢測大鼠肺組織中HYP含量。

1.4動脈血?dú)夥治?經(jīng)大鼠左心室取血，采用雅培便攜式生化檢測儀(i-STAT)測定大鼠動脈血氧分壓(PaO2)和動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)。

1.5氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志分子檢測 按照試劑盒說明書檢測大鼠肺組織勻漿中氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物分子MDA的含量、MPO及SOD的活性。

1.6炎癥因子檢測 采用ELISA法檢測大鼠肺組織勻漿中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α 的表達(dá)水平。

1.7qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 大鼠肺組織勻漿采用Trizol法提取總RNA，定量分析后，取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實(shí)時定量PCR試劑盒通過實(shí)時熒光定量PCR儀(ABI 7500)進(jìn)行定量并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1柚皮苷對百草枯導(dǎo)致的大鼠肺組織病理損傷及肺功能損傷的影響 大鼠肺組織W/D與HYP含量的測定結(jié)果顯示，與空白對照組比較，百草枯組大鼠肺組織W/D及HYP明顯增加，而百草枯+柚皮苷組中兩項(xiàng)指標(biāo)增加的程度明顯低于百草枯組(P均<0.05)。大鼠肺組織切片HE染色結(jié)果顯示，與空白對照組比較，百草枯組大鼠肺組織中大量炎性滲出，炎癥細(xì)胞浸潤，且肺泡正常結(jié)構(gòu)被破壞；而百草枯+柚皮苷組大鼠肺組織炎癥反應(yīng)明顯減輕，滲出減少，肺組織結(jié)構(gòu)得到一定保護(hù)。大鼠動脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，與空白對照組比較，百草枯組大鼠血PaO2明顯降低，PaCO2明顯升高，但在百草枯+柚皮苷組中PaO2降低與PaCO2升高的幅度均明顯低于百草枯組(P均<0.05)。見圖1。

注：c為大鼠肺組織切片HE染色代表圖(比例尺為200 μm)；W/D為濕/干重比，HYP為羥脯氨酸；PaCO2為動脈血二氧化碳分壓；PaO2為動脈血氧分壓；與空白對照組比較，*P<0.05；與百草枯組比較，#P<0.05

2.2柚皮苷對百草枯導(dǎo)致的大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的影響 通過試劑盒檢測大鼠肺組織勻漿中MDA含量、MPO活性和SOD活性，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，百草枯組MDA含量與MPO活性明顯增加，而SOD活性明顯降低，而百草枯+柚皮苷組中三項(xiàng)指標(biāo)變化的幅度較百草枯組明顯降低(P均<0.05)。見圖2。

注：MPA為丙二醛；MPO為髓過氧化物酶；SOD為超氧化物歧化酶；與空白對照組比較，*P<0.05；與百草枯組比較，#P<0.05

2.3ELISA檢測柚皮苷對百草枯導(dǎo)致的肺組織炎癥水平的影響 通過ELISA檢測大鼠肺組織中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，百草枯組IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平明顯增加，而百草枯+柚皮苷組中IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)水平增加幅度較百草枯組明顯降低(P均<0.05)。見圖3。

注：IL-1β為細(xì)胞介素-1β；IL-6為白細(xì)胞介素-6；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與空白對照組比較，*P<0.05；與百草枯組比較，#P<0.05

2.4qRT-PCR檢測柚皮苷對百草枯導(dǎo)致的大鼠肺組織纖維化相關(guān)因子的影響 采用qRT-PCR檢測大鼠肺組織中TGF-β1、結(jié)締組織生長因子(CTGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)三種肺組織纖維化相關(guān)因子的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，百草枯組TGF-β1、CTGF和MMP2的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，而百草枯+柚皮苷組中其上調(diào)幅度較百草枯組明顯降低(P均<0.05)。見圖4。

注：縱坐標(biāo)為倍數(shù)改變；TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長因子-β1；CTGF為結(jié)締組織生長因子；MMP2為基質(zhì)金屬蛋白酶2；mRMA為信使核糖核酸；與空白對照組比較，*P<0.05；與百草枯組比較，#P<0.05

3 討論

肺是百草枯中毒后的主要靶器官，針對百草枯導(dǎo)致的肺損傷和肺纖維化發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及干預(yù)，已有大量相關(guān)文獻(xiàn)。其中在藥物干預(yù)方面，除激素、環(huán)磷酰胺及抗氧化劑外，烏司他丁、血必凈、生長抑素等近年來也被報(bào)道能夠減輕百草枯所致的肺損傷[5-7]。同時，多種中藥成分也在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)能夠減輕百草枯誘導(dǎo)的肺損傷。周鵬等[8]研究發(fā)現(xiàn)，聚原花青素對百草枯染毒小鼠具有保護(hù)作用，能夠延長染毒后小鼠生存時間，減輕炎癥反應(yīng)。黃芪多糖能夠通過抑制TGF-β1/Smads信號通路減輕百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[9]。唐燕等[10]采用腹腔注射姜黃素干預(yù)百草枯中毒大鼠，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠提高大鼠生存率，改善呼吸功能指標(biāo)及抑制TGF-β1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的過度表達(dá)。柚皮苷是近年來研究較多的一種二氫黃酮類化合物，已被證實(shí)能夠通過抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用在多種疾病中發(fā)揮潛在治療價值。有研究[11]表明，柚皮苷是防治肥胖、心臟病、糖尿病和代謝綜合征等的重要天然物質(zhì)。柚皮苷還對多種藥物和化學(xué)毒物造成的肝功能損傷具有一定的保護(hù)作用[4]。此外，柚皮苷能夠通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p53和NF-κB等信號通路對環(huán)境毒物丙烯醛造成的小鼠肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用[12]。

在本研究中，肺組織切片鏡檢、HYP含量和W/D測定結(jié)果均提示柚皮苷能夠顯著減輕百草枯導(dǎo)致的大鼠肺損傷，減輕炎細(xì)胞浸潤和滲出，減少膠原蛋白的形成，同時血?dú)夥治鼋Y(jié)果表明柚皮苷能夠改善大鼠肺功能。百草枯是一種較強(qiáng)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)物，通過對肺組織MDA含量以及MPO、SOD的活性測定發(fā)現(xiàn)，柚皮苷具有顯著的抑制氧化應(yīng)激和提高組織抗損傷能力的作用。Han等[13]在蛛網(wǎng)膜下腔出血的研究中也發(fā)現(xiàn)，柚皮苷能改善神經(jīng)功能缺損、腦水腫和血腦屏障的完整性，這與其減輕氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。與最新的文獻(xiàn)[14]報(bào)道類似，柚皮苷具有抗炎作用，能夠抑制百草枯導(dǎo)致的IL-1β、IL-6和TNF-α的過表達(dá)。

進(jìn)一步對TGF-β1、CTGF和MMP2的組織表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，柚皮苷能夠抑制百草枯所致的上述細(xì)胞因子的基因表達(dá)。TGF-β1是經(jīng)典的組織損傷修復(fù)、重構(gòu)與促纖維化分子，有研究[15]表明其參與百草枯所致的人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)損傷調(diào)節(jié)和抑制NOD樣受體家族蛋白(NLRP3)活化。CTGF是CCN家族成員之一，參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞黏附、增殖、分化、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的產(chǎn)生[16]。近年研究發(fā)現(xiàn)，CTGF與腫瘤及纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，與多種因素包括百草枯導(dǎo)致的肺損傷后肺纖維化有關(guān)。作為TGF-β1下游協(xié)同介質(zhì)，CTGF被TGF-β1轉(zhuǎn)錄激活，是促轉(zhuǎn)分化、促進(jìn)增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積的重要分子。MMP2也是TGF-β1下游重要分子，能夠分解基底膜損傷肺泡結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)一步促進(jìn)肺損傷和纖維化的發(fā)生發(fā)展[17]。因此，柚皮苷可能通過抑制上述細(xì)胞因子進(jìn)而影響相關(guān)信號途徑發(fā)揮保護(hù)作用。阮丹等[18]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素可以激活重組與合成蛋白(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)信號通路，促進(jìn)SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的釋放，發(fā)揮對百草枯中毒大鼠的急性肺損傷保護(hù)的作用[20]。

綜上所述，柚皮苷在百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺損傷過程中可以發(fā)揮抗氧化及抗炎等作用，從而減輕肺損傷和改善肺功能。由于柚皮苷在天然植物中廣泛存在且在多種疾病中被證實(shí)有一定的防治作用，因此也具有較好的臨床應(yīng)用前景。