倫永志，孫 杰，魏 玲，2，劉 奔，董 雯，潘凌鴻

（1. 莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生態(tài)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建莆田 351100；2. 北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089）

人絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine proteinase inhibitors,Serpins）是一類(lèi)參與人體諸多生理過(guò)程的活性調(diào)節(jié)因子。迄今為止已發(fā)現(xiàn)動(dòng)物、植物、古細(xì)菌、細(xì)菌、病毒中均存在Serpins，大約1 500個(gè)成員至少分屬于20個(gè)基因家族[1]，Kazal型Serpins是其中較為保守的家族之一。Hespintor是本課題組在2005年從肝癌細(xì)胞Hep G2中首次篩選發(fā)現(xiàn)，2006年3月提交序列至GenBank（DQ438947），2018年6月正式命名為Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑13（SPINK13）[2]。在前期工作中，已證實(shí)Hespintor重組蛋白質(zhì)可在體外明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，并對(duì)肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤皮下生長(zhǎng)具有良好的抑制作用[3-5]，使其有望成為新型腫瘤靶向治療藥物。研究表明，諸如Hespintor等Serpins可在胞外通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）活化，從而控制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力[6]。此后，Serpins可經(jīng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入胞內(nèi)[6]，由于入胞后的代謝轉(zhuǎn)歸和生物學(xué)功能等研究較少，其胞內(nèi)靶蛋白質(zhì)或靶蛋白酶較難確定，因此后續(xù)的作用機(jī)制尚不清楚。

研究顯示，無(wú)論是編碼蛋白質(zhì)的mRNA還是以參與調(diào)控為主的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展均有重要影響，其中l(wèi)ncRNA在表觀遺傳、細(xì)胞周期及細(xì)胞分化等調(diào)控中發(fā)揮重要作用[7]，并且差異表達(dá)lncRNA調(diào)控的靶基因在功能富集方面表現(xiàn)更為全面[8]。本研究基于裸鼠移植瘤Hespintor治療組及溶劑對(duì)照組的比較轉(zhuǎn)錄物組結(jié)果，分別篩選lncRNA、mRNA差異表達(dá)基因 集（differential expression genes,DEGs），針 對(duì)DEGs lncRNA調(diào)控靶基因、DEGs mRNA，利用網(wǎng)絡(luò)模塊劃分方法篩選Hespintor作用靶點(diǎn)基因并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為探究Hespintor分子調(diào)控機(jī)制及可用于臨床診療的分子靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和重組蛋白質(zhì)

人高侵襲性肝癌細(xì)胞系MHCC97-H購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)公司（北京），細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的DMEM（1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)基，置于37℃、50 mL/L CO2常規(guī)培養(yǎng)，1～2 d傳代1次。純化的Hespintor重組蛋白質(zhì)由本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中利用Ni-NTA親和層析方法制備[4-5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模與分組

SPF級(jí)裸鼠12只，6～8周齡，雄性，體質(zhì)量（22±3）g，購(gòu)自重慶恩斯維爾生物科技有限公司。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97-H細(xì)胞，制備成1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每只裸鼠于右腋皮下緩慢接種200μL細(xì)胞懸液。裸鼠荷瘤1 d后隨機(jī)分為2組，每組6只，2 d后開(kāi)始給藥。Hespintor治療組按尾靜脈注射Hespintor溶液，劑量為20μg/kg；溶劑對(duì)照（solvent control）組按尾靜脈注射生理鹽水，劑量為20μg/kg。移植瘤模型裸鼠尾靜脈注射給藥時(shí)間均為第1～2周每周給藥2次，第3～4周每周給藥3次。最后一次2 d后給藥，70 g/L。水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為5 mL/kg，麻醉后剝離瘤塊。瘤塊用生理鹽水沖洗并立即放入液氮中，之后迅速轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序分析

由重慶威斯騰生物公司完成后續(xù)的組織RNA提取及檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建，庫(kù)檢合格后進(jìn)行Illumina PE150測(cè)序。獲得的原始測(cè)序序列先進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，經(jīng)過(guò)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾、測(cè)序錯(cuò)誤率檢查及GC含量分布檢查后獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的clean reads，利用Hisat2 v2.0.5將reads比對(duì)到參考基因組（Ensembl 75），繼而利用StringTie v2.1.1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物拼接，再利用Cuffmerge v2.2.1去除不合格的拼接轉(zhuǎn)錄物，然后利用Cuffdiff v2.2.1進(jìn)行差異表達(dá)顯著性分析。

1.4 差異表達(dá)基因集的篩選及相互作用分析

DEGs lncRNA、DEGs mRNA（候選基因集標(biāo)記為DM）篩選標(biāo)準(zhǔn)均為│log FC│≥2、P＜0.05。利用lncRNA與編碼基因的位置關(guān)系（co-location）預(yù)測(cè)DEGs lncRNA調(diào)控靶基因，篩選閾值為差異表達(dá)lncRNA上下游20 kb內(nèi)；為保證預(yù)測(cè)結(jié)果的真實(shí)性，將篩選得到的DEGs lncRNA調(diào)控靶編碼基因與轉(zhuǎn)錄物組全部mRNA同時(shí)提交至韋恩圖在線(xiàn)繪制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn），取兩者交集作為候選基因集（標(biāo)記為DL-M），確保進(jìn)入后續(xù)分析的DEGs lncRNA調(diào)控靶編碼基因均為真實(shí)表達(dá)。選取DM差異表達(dá)倍數(shù)分別排在前30位的上調(diào)、下調(diào)基因，利用Cluster v3.01和Heml v1.0根據(jù)FPKM值繪制聚類(lèi)熱圖。將DM、DL-M兩組基因集分別提交至Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org），分別進(jìn)行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和Reactome通路（pathway）富集分析。富集標(biāo)準(zhǔn)為Min Overlap≥3、PValue Cutoff≤0.05，其余選擇默認(rèn)值[9]。再將上述兩組基因集分別提交至String在線(xiàn)工具（http://string-db.org）構(gòu)建可視化相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，參數(shù)設(shè)置為meaning of network edges：confidence，active interaction sources：Experiments、Databases，minimum required interaction score≥0.7（滿(mǎn)分為1），hide disconnected nodes in the network，其余選擇默認(rèn)值[10]。

1.5 靶點(diǎn)基因的篩選及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將具有相互作用關(guān)系的2組基因集分別導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，先利用MCODE插件篩選出構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的核心（Core）基因，參數(shù)設(shè)置為degree cutoff≥3、K-Core≥4，其余選擇默認(rèn)值；再利用CentiScape插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)及各個(gè)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)涮匦?，?guī)定degree value≥Mean+SD的節(jié)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)基因?yàn)闃屑~（Hub）基因，betweenness value≥Mean+SD的節(jié)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)基因?yàn)槠款i（bottleneck）基因。取三者交集作為靶點(diǎn)基因，匯總注釋得到的重要通路、關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)基因及其調(diào)控DEGs lncRNA，分別建立相互關(guān)系文本并導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 q RT-PCR驗(yàn)證靶點(diǎn)基因的表達(dá)

按PureLink Total RNA Kit（Thermo Fisher Scientific，上海）說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，以β-actin內(nèi)參基因，利用qRT-PCR和2-ΔΔCt法檢測(cè)關(guān)聯(lián)的DEGs mRNA、DEGs lncRNA相對(duì)表達(dá)量。以總RNA為模板，按PrimeScript RT Reagent kit（TaKaRa，北京）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得產(chǎn)物即為cDNA，稀釋10倍后用于后續(xù)qPCR。反應(yīng)體系：Power SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，上海）5.0μL、cDNA 2.0μL、Forward Primer（10μmol/L）0.5μL、Reverse Primer（10μmol/L）0.5μL、DNase Free dH2O up to 10.0μL；反應(yīng)條件：95℃10 min、95℃15 s、60℃1 min（40 cycles）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR的各基因引物序列Tab.1 qPCR Primer sequences

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別培養(yǎng)于含0、15μg/mL Hespintor無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中48 h，經(jīng)胰酶消化后，離心收集細(xì)胞沉淀，加入預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸棄上清；加入預(yù)冷的700 mL/L乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定過(guò)夜，離心沉淀細(xì)胞。按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)（Beyotime，上海）操作，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）至終質(zhì)量濃度為50 mg/L，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴30 min，采用激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm的紅色熒光檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。利用細(xì)胞周期擬合軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，記錄亞二倍體峰，即G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用Tukey檢驗(yàn)，圖中所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式呈現(xiàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組Hespintor對(duì)MHCC97-H細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用

通過(guò)將MHCC97-H肝癌細(xì)胞皮下注射至裸鼠體內(nèi)獲得移植瘤模型。荷瘤3 d后，裸鼠尾靜脈注射給藥治療4周后，剝瘤稱(chēng)重并測(cè)量體積，分別計(jì)算抑瘤率。重組Hespintor治療組相比溶劑對(duì)照組明顯抑制了裸鼠中MHCC97-H肝癌細(xì)胞的皮下生長(zhǎng)（圖1），抑瘤率分別達(dá)到24.21%、29.76%。

圖1 重組Hespintor抑制裸鼠MHCC97-H細(xì)胞皮下生長(zhǎng)Fig.1 Recombinant Hespintor inhibited the subcutaneous growth of MHCC97-H cells in nude mice

2.2 轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估與聚類(lèi)分析

分別構(gòu)建Hespintor治療組和溶劑對(duì)照組裸鼠移植瘤cDNA文庫(kù)并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序，所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾、測(cè)序錯(cuò)誤率檢查及GC含量分布檢查以去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，再將有效測(cè)序數(shù)據(jù)（clean reads）比對(duì)到人類(lèi)參考基因組。Hespintor治療組和溶劑對(duì)照組分別獲得91 230 446和98 123 016個(gè)有效測(cè)序數(shù)據(jù)（圖2A），Q30質(zhì)量值分別達(dá)到92.9%、94.07%（圖2B），GC含量分別達(dá)到49.23%、51.39%；Hespintor治療組移植瘤與參考基因組的比對(duì)率為85.9%，溶劑對(duì)照組移植瘤與參考基因組的比對(duì)率為82.85%，在參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置的reads數(shù)量（multiple mapped reads）占比率分別為3.79%、4.52%。上述結(jié)果表明，測(cè)序質(zhì)量較高且結(jié)果可信，符合后續(xù)分析要求。將比對(duì)結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物拼接，利用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄物每百萬(wàn)映射讀取的片段值（fragments per kilobase of exon per million reads mapped，F(xiàn)PKM）定量mRNA、lncRNA表達(dá)水平（圖2C）。根據(jù)DM差異基因表達(dá)值顯著聚類(lèi)為2大類(lèi)（圖2D）。

圖2 Hespintor治療組與溶劑對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估與差異表達(dá)的顯著性分析Fig.2 RNA-Seq quality assessment and significance analysis of differential expression between Hespintor treatment and solvent control

2.3 差異表達(dá)基因集主要富集于細(xì)胞行為、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期等功能

為了提高顯著性分析水平，按照自定義篩選條件，共計(jì)得到DEGs lncRNA 2 003個(gè)，其中上調(diào)基因1 090個(gè)、下調(diào)基因913個(gè)。剔除實(shí)際未表達(dá)的編碼基因，預(yù)測(cè)得到DEGs lncRNA調(diào)控靶基因共計(jì)1 332個(gè)（即為DL-M）；共計(jì)篩選得到1 038個(gè)DEGs mRNA（即為DM），其中上調(diào)基因570個(gè)、下調(diào)基因468個(gè)。

將DM、DL-M作為后續(xù)分析的候選基因集。DM顯著富集于神經(jīng)調(diào)控、細(xì)胞行為和凝血功能等三類(lèi)重要KEGG通路（圖3A）：①神經(jīng)活性配體受體相互作用、谷氨酸能突觸、鞘氨醇生物合成等；②趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、cAMP信號(hào)通路等；③補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)。以上結(jié)果與Reactome通路富集結(jié)果相吻合：①神經(jīng)元系統(tǒng)；②G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor,GPCR）配體結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)組織、淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞之間的免疫調(diào)節(jié)相互作用等；③血管壁細(xì)胞表面的相互作用、補(bǔ)體激活的凝集素途徑等。KEGG及Reactome通路分析結(jié)果顯示，相較DM，DL-M涉及功能更廣泛，兩者關(guān)聯(lián)性側(cè)重體現(xiàn)在細(xì)胞行為、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期等三方面（圖3B）：①M(fèi)APK信號(hào)通路和PIP3激活A(yù)kt信號(hào)、細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑等；②p53信號(hào)通路和TP53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、FOXO介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄等；③細(xì)胞周期（KEGG及Reactome通路同時(shí)富集得到）。值得關(guān)注的是，DM、DL-M富集結(jié)果交互貫通，其中GPCR信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、細(xì)胞周期信號(hào)通路等不僅與細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系密切相關(guān)，且彼此之間相互影響。將DM、DL-M分別上傳至String在線(xiàn)工具，按設(shè)置參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)篩選后，去除重復(fù)及無(wú)相互作用孤立的基因后，DM構(gòu)建的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)包括956個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)、1 101條關(guān)系對(duì)，DL-M蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)共計(jì)1 285個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)、1 810條關(guān)系對(duì)（圖4）。

圖3 候選基因集富集分析結(jié)果Fig.3 The results of enrichment analysis of candidate gene set

圖4 候選基因集蛋白質(zhì)相互作用分析結(jié)果Fig.4 T he result of protein-protein interaction network analysis of candidate gene set

2.4 差異表達(dá)基因集交互作用網(wǎng)絡(luò)核心、樞紐、瓶頸節(jié)點(diǎn)及Hespintor作用靶點(diǎn)基因的篩選

將圖3兩組蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分別導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化。利用該軟件“MCODE”插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行K核解析，按設(shè)置參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)篩選后，DM、DL-M分別獲得10個(gè)、15個(gè)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的核心基因集（圖5A、圖5B），分別包括109個(gè)、205個(gè)核心基因（core genes）。利用Cytoscape軟件“CentiScape”插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)及各個(gè)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)涮卣?，Degree為節(jié)點(diǎn)連接的邊的總數(shù)目，按設(shè)置參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)篩選后，分別獲得樞紐基因（hub genes）45個(gè)、76個(gè)；Betweenness為網(wǎng)絡(luò)中所有的最短路徑中經(jīng)過(guò)該節(jié)點(diǎn)的數(shù)量比例，按設(shè)置參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)篩選后，分別獲得瓶頸基因（bottleneck gene）25個(gè)、47個(gè)。同時(shí)為核心基因、樞紐基因和瓶頸基因者對(duì)所在網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要，即為Hespintor作用靶點(diǎn)基因（圖5C）。DM靶點(diǎn)基因共計(jì)7個(gè)，其中CXCR4、LCK為上調(diào)基因，其余為下調(diào)基因；DL-M靶點(diǎn)基因共計(jì)21個(gè)，只有GNG13為下調(diào)基因，其余均非DEGs mRNA（表2）。

表2 候選基因集靶點(diǎn)基因的篩選Tab.2 Identification result of target genes of candidate gene set

圖5 核心基因集結(jié)構(gòu)和候選基因集靶點(diǎn)基因的篩選Fig.5 Interaction diagram of core genes and identification of target genes of the candidate gene set

2.5 構(gòu)建DEGs lnc RNA-target gene-KEGG/Reactome pathway可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

以溶劑對(duì)照組為基準(zhǔn)，選擇關(guān)聯(lián)重要通路的靶點(diǎn)基因或其調(diào)控DEGs lncRNA進(jìn)行表達(dá)水平驗(yàn)證（圖6）。研究表明，qPCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序結(jié)果相符，這為進(jìn)一步開(kāi)展機(jī)制研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。將以上靶點(diǎn)基因、與之調(diào)控相關(guān)的DEGs lncRNA和注釋得到的重要通路導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建一個(gè)

圖6 重要通路關(guān)聯(lián)的差異表達(dá)基因相對(duì)表達(dá)水平的q PCR驗(yàn)證Fig.6 Verification of the relative expression levels of DEGs mRNA,DEGs lncRNA related to important pathways by qPCR

DEGs lncRNA-target gene-KEGG/Reactome pathway可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共計(jì)42個(gè)節(jié)點(diǎn)（17個(gè)靶點(diǎn)基因、11個(gè)lncRNA和14條通路）及63個(gè)關(guān)系對(duì)。Hespintor調(diào)控通路主要集中于GPCR信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路和細(xì)胞周期通路等，這些通路均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)且彼此關(guān)聯(lián)（圖7）。同時(shí)，Hespintor能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G1/S期（圖8）。

圖7 DEGs lncRNA-tar get gene-KEGG/Reactome pathway調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.7 DEGs lncRNA-target gene-KEGG/Reactome pathway regulatory network

圖8 Hespintor作用MHCC97-H細(xì)胞后的細(xì)胞周期阻滯變化Fig.8 Changes of cell cycle arrest in MHCC97-H cells treated with Hespintor

3 討 論

蛋白酶抑制劑在腫瘤中的作用機(jī)制非常復(fù)雜，具有抑制和促進(jìn)的矛盾表現(xiàn)，原因在于作用底物的種類(lèi)和性質(zhì)。除了蛋白酶抑制劑直接與上下游底物互作外，功能各異的不同底物與其他蛋白質(zhì)之間的交互關(guān)系也影響了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程[11]。腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)往往取決于某種相互作用能否通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等，以及血管形成等生理過(guò)程，進(jìn)而擴(kuò)大并固化細(xì)胞間的分子差異和最終結(jié)局。Serpins在胞外通過(guò)抑制尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator,uPA）的絲氨酸蛋白酶活性可間接抑制MMPs活性，避免細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）及基底膜（basement membrane,BM）發(fā)生局灶性蛋白質(zhì)水解，從而阻止腫瘤細(xì)胞的侵襲或（和）遷移[12-14]。Serpins經(jīng)內(nèi)吞作用入胞后的作用機(jī)制和對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響尚有待于研究。

前期研究表明，Hespintor能夠激活促凋亡因子Bax和Caspase-3的表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)[4-5]，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑瘤作用。Bax通過(guò)改變線(xiàn)粒體膜通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，經(jīng)Caspase途徑激活Caspase-3及后續(xù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]，這表明線(xiàn)粒體凋亡途徑極有可能是Hespintor促凋亡機(jī)制之一。但因此而產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控具有兩面性：一般來(lái)說(shuō)，ROS能夠激活與增殖、存活、血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；過(guò)量ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激機(jī)制則可引起損傷。根據(jù)ROS水平和暴露時(shí)間的不同，可以激發(fā)腫瘤細(xì)胞存活或凋亡機(jī)制[16]：低水平的ROS可作為有絲分裂原引起細(xì)胞增殖；中等水平的ROS可誘導(dǎo)細(xì)胞周期暫時(shí)或永久阻滯并促進(jìn)細(xì)胞分化；高水平的ROS可破壞生物大分子從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。由于代謝異常和線(xiàn)粒體功能障礙，抵抗內(nèi)源性ROS升高是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征，這使得腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)ROS額外升高的能力變得有限，反而更容易受到氧化應(yīng)激損傷[18-19]。充分利用ROS與抗氧化應(yīng)激之間的微妙平衡，通過(guò)誘生高濃度的ROS來(lái)消除腫瘤細(xì)胞的抗氧化防御能力而促進(jìn)凋亡[20]，并借此達(dá)到治療的目的。

以數(shù)據(jù)挖掘與分析為主體內(nèi)容的生物信息學(xué)已被廣泛應(yīng)用于包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病診療機(jī)制研究。利用網(wǎng)絡(luò)模塊劃分方法，有助于發(fā)現(xiàn)“疾病與基因”之間的關(guān)聯(lián)，網(wǎng)絡(luò)模塊的“網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵”值越小，則該模塊就越穩(wěn)定、可信度也越高，采用MCODE cluster方法劃分網(wǎng)絡(luò)模塊后的熵值最小[21]。DEGs mRNA中的關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)基因主要參與GPCR信號(hào)通路。CXCR4作為其中最重要的趨化因子受體之一，在高活性氧或低氧環(huán)境中通過(guò)形成CXCL 12/CXCR4生物軸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[22]；C3、GNG13、GNGT 2、PF4、TACR1本身就是Gαi蛋白質(zhì)和（或）Gαq蛋白質(zhì)組分，多個(gè)有絲分裂原均可通過(guò)Gαi蛋白質(zhì)、Gαq蛋白質(zhì)傳遞細(xì)胞增殖信號(hào)[23]。ROS通過(guò)氧化半胱氨酸殘基使磷酸酶張力蛋白同源物（PTEN）失活，繼而活化磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/缺氧誘導(dǎo)因子1α（PI3K/Akt/HIF-1α）信號(hào)通路增加CXCR4表達(dá)[24]。因此，腫瘤細(xì)胞極有可能通過(guò)以上途徑借以逃避氧化應(yīng)激損傷和死亡。Hespintor在實(shí)體瘤組織的分布必定有限且不均勻，組織內(nèi)圍更易產(chǎn)生中低水平的ROS并經(jīng)依賴(lài)ROS介導(dǎo)機(jī)制促進(jìn)uPA、uPAR、CXCR4表達(dá)[24-26]。這意味著Hespintor用藥劑量應(yīng)著重考慮ROS濃度，且在一定程度上可以解釋Serpins在腫瘤中的矛盾表現(xiàn)。

真核細(xì)胞中存在著由lncRNA參與構(gòu)成的復(fù)雜而重要的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在調(diào)控細(xì)胞周期、疾病發(fā)生、干細(xì)胞分化和細(xì)胞重編程等方面發(fā)揮重要功能[27]。目前認(rèn)為，lncRNA可通過(guò)行使信號(hào)分子、支架分子、誘餌分子和引導(dǎo)分子等功能，從轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳三個(gè)層面體現(xiàn)其順式或反式中心調(diào)控作用，lncRNA調(diào)控靶基因的生物學(xué)效果與意義比mRNA更加直接和明顯[28]。受DEGs lncRNA調(diào)控的關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)基因主要參與PI3K/Akt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路和細(xì)胞周期信號(hào)通路，整合GPCR信號(hào)通路分析可知，以上通路交聯(lián)貫通，尤其是PI3K/Akt通路可能在其中發(fā)揮了主導(dǎo)作用，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G1/S期并引起細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為，PI3K/Akt通路是介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基本途徑，Akt通過(guò)磷酸化方式活化下游多個(gè)通路而抗凋亡，并使細(xì)胞周期失控促進(jìn)增殖，但物極必反，Akt也可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和凋亡增加[29]。作為GPCR主要的下游效應(yīng)器，活化的PI3K催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3），后者作為一種信號(hào)分子招募并激活磷酸肌醇依賴(lài)性激酶（PDK），隨后經(jīng)磷酸化激活A(yù)kt，p-Akt再激活其靶蛋白質(zhì)，包括Bcl-xl/Bcl-2相關(guān)死亡啟動(dòng)因子（BAD）、叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O1（FOXO1）、糖原合酶激酶3（GSK3）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白1（mTOR1）等，p53泛素化降解同樣需要p-Akt介導(dǎo)的雙微體2（MDM 2）磷酸化[30]，并最終影響后續(xù)一系列的轉(zhuǎn)錄[31]。原本ROS致PTEN失活可激活A(yù)kt，此時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖，然而當(dāng)ROS繼續(xù)積累時(shí)又可引發(fā)細(xì)胞凋亡。除了ROS破壞生物大分子機(jī)制外，尚涉及多個(gè)機(jī)制且均與p-Akt相關(guān)：①HIF1α的穩(wěn)定依賴(lài)于E3蛋白連接酶（pVHL）活性，HIF1α活性的降低與p VHL活性的增加成反比，pVHL上含有p-Akt底物位點(diǎn)，其磷酸化后可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29]；②腫瘤抑制因子BRCA 1同樣含有p-Akt磷酸化位點(diǎn)，活化的BRCA 1可增強(qiáng)其在細(xì)胞核中的定位和依賴(lài)BRCA 1的轉(zhuǎn)錄活性[32]；③p-Akt通過(guò)抑制由FOXO1介導(dǎo)的腫瘤抑制功能，使細(xì)胞傾向于依賴(lài)ROS的方式致凋亡[33]；④p-Akt通過(guò)誘導(dǎo)凋亡素（apoptin）發(fā)揮其腫瘤抑制功能[34]；⑤積累的ROS通過(guò)激活酪氨酸磷酸酶（SHP-TP1）使p-Akt去磷酸化[35]；⑥蛋白磷酸酶2A（PP2A）對(duì)積累的ROS敏感，導(dǎo)致Akt-PP2A相互作用增強(qiáng)使p-Akt去磷酸化[36]。

本研究通過(guò)整合分析mRNA-seq與lncRNA-seq，發(fā)現(xiàn)Hespintor入胞后可能經(jīng)線(xiàn)粒體凋亡途徑產(chǎn)生ROS，進(jìn)而調(diào)控下游多個(gè)信號(hào)通路，為揭示Hespintor作用機(jī)制提供了重要線(xiàn)索。同時(shí)，上述靶點(diǎn)基因及通路有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并且需要深入探討Hespintor的量效關(guān)系及毒性作用，以評(píng)估其作為抗腫瘤藥物的潛力。