宋 昕，孫 瑩，張 琦，耿 濤

(應(yīng)急總醫(yī)院干部療養(yǎng)科，北京100020)

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨代謝疾病，主要表現(xiàn)為骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞，增加骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，是世界公共衛(wèi)生的重大問(wèn)題之一[1]?；颊咭耘跃佣啵^經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率超過(guò)35%，嚴(yán)重影響老年女性生活質(zhì)量和生命安全[2]。腸道菌群是人體內(nèi)最大的生態(tài)系統(tǒng)，近年來(lái)隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)與腫瘤、炎癥、糖尿病等疾病的發(fā)生具有密切聯(lián)系[3]，而腸道菌群失調(diào)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、激素水平以及骨代謝等方式促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和進(jìn)展，是導(dǎo)致老年女性骨質(zhì)疏松癥的重要因素[4]。研究表明，核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)-核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)-骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)通路在維持骨吸收與骨形成的平衡中發(fā)揮重要作用，外源性O(shè)PG具有延緩骨質(zhì)流失的作用[5]。但目前腸道菌群失調(diào)通過(guò)RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨代謝影響骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的研究尚不完全明確，本研究通過(guò)對(duì)絕經(jīng)后老年骨質(zhì)疏松患者骨代謝與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系進(jìn)行研究，旨在為老年女性骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供相關(guān)依據(jù)。報(bào)告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2019年1月—2021年1月于我院就診的老年骨質(zhì)疏松老年女性患者177例為研究對(duì)象，骨質(zhì)疏松診斷依據(jù)《絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影像學(xué)表現(xiàn)及診斷標(biāo)準(zhǔn)》[6]，所有患者行腸道細(xì)菌涂片培養(yǎng)后計(jì)算雙歧桿菌/腸桿菌值，根據(jù)《腸道菌群失調(diào)診斷治療建議》[7]將患者分為研究組(腸道菌清失調(diào)，雙歧桿菌/腸桿菌<1，78例)和對(duì)照組(腸道菌群未失調(diào)，雙歧桿菌/腸桿菌>1，99例)。2組患者均為絕經(jīng)后女性，研究組年齡53～75歲，平均(62.15±8.21)歲、對(duì)照組年齡52～75歲，平均(62.21±7.13)歲；認(rèn)知功能正常、生活能力正常、臨床資料完整，無(wú)合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、重要臟器功能障礙及精神神經(jīng)疾病。

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò),所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2腸道菌群的分離及鑒定 所有患者入組后收集1 g左右新鮮糞便于潔凈容器中，采用10倍稀釋法進(jìn)行稀釋后進(jìn)行培養(yǎng)，使用法國(guó)梅里埃公司VITEK2 Compact全自行微生物鑒定系統(tǒng)檢測(cè)微生物分布情況，主要檢測(cè)糞便中雙歧桿菌和腸桿菌，結(jié)果采用(lg菌落數(shù)/g)表示。見(jiàn)表1。

表1 2組腸道菌群比較Table 1 Comparison of intestinal flora between two groups 菌落數(shù)/g)

1.3炎癥因子及骨代謝指標(biāo)水平檢測(cè) 患者入組后次日清晨空腹抽取靜脈血5 mL于無(wú)菌管中，3 000 r/min離心10 min收集上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血清骨鈣素(osteocalcin，OC)、骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase，BALP)、25-羥維生素D[25-hydroxyvitamin D，25(OH)D]、抗酒石酸鹽酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b)等骨代謝指標(biāo)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書所述步驟進(jìn)行，血清ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.4RANKL/RANK/OPG通路蛋白水平檢測(cè) 無(wú)菌抽取患者膝關(guān)節(jié)囊內(nèi)關(guān)節(jié)液于無(wú)菌管中，加入RIPA蛋白裂解液于冰上裂解40 min，12 000 r/min離心10 min后吸取上清，采用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行校準(zhǔn)，加入4×Loading Buffer煮樣后進(jìn)行聚丙烯酰胺-凝膠電泳，電泳結(jié)束將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜中，封閉1 h后加入1∶1 000稀釋的一抗于4 ℃條件下孵育過(guò)夜，次日再加入二抗室溫孵育1 h，檢測(cè)RANKL、RANK、OPG蛋白表達(dá)水平，以GAPDH最為內(nèi)參，以目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值為蛋白相對(duì)表達(dá)量，RANKL、RANK、OPG兔抗人一抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗及Western-blot試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司，Simon 全自動(dòng)Western-blot監(jiān)測(cè)分析儀購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組患者血清炎癥因子水平比較 研究組患者血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.22組患者血清骨代謝指標(biāo)比較 研究組患者血清OC、BALP、TRACP-5b水高于對(duì)照組，血清25(OH)D水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.32組關(guān)節(jié)液RANKL/RANK/OPG通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 研究組患者關(guān)節(jié)液中RANKL、RANK蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表2 2組IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較Table 2 Comparison of IL-6，TNF-α，and TGF-β1 levels between two groups

表3 2組血清OC、BALP、TRACP-5b、 25(OH)D水平比較Table 3 Comparison of serum OC,BALP, TRACP-5b and 25(OH)D levels between two groups

表4 2組關(guān)節(jié)液RANKL、RANK、OPG蛋白 相對(duì)表達(dá)量比較Table 4 Comparison of the relative expression of RANKL, RANK and OPG protein in synovial fluid between two groups

2.4研究組腸道菌群和骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性 研究組雙歧桿菌與血清25(OH)D水平呈正相關(guān)(r=0.332，P<0.05)，與血清OC、BALP和TRACP-5b水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.318、-0.408、-0.371，P<0.05)；腸桿菌與血清25(OH)D水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.378，P<0.05)，與血清OC、BALP和TRACP-5b水平呈正相關(guān)(r=0.356、0.343、0.364，P<0.05)。

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥是常見(jiàn)的骨質(zhì)退化性疾病，隨著我國(guó)人口老齡化的加重骨質(zhì)疏松癥患者也日益增多，骨密度降低導(dǎo)致的骨量水平降低是其主要臨床表現(xiàn)，增加患者骨折風(fēng)險(xiǎn)[8]。骨代謝過(guò)程包括舊骨吸收和新骨形成2個(gè)過(guò)程，兒童以及青少年使其骨形成過(guò)程大于骨吸收，使骨骼增長(zhǎng)迅速，骨容量在30歲左右達(dá)到峰值。而在女性絕經(jīng)以及男性50歲之后，骨吸收過(guò)程大于骨形成，使得骨量減少，骨質(zhì)脆性增加，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展。老年女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥又稱Ⅰ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，雌激素水平大量下降是導(dǎo)致其發(fā)生的重要原因[9]。雌激素能夠與破骨細(xì)胞內(nèi)雌激素受體結(jié)合促進(jìn)降鈣素分泌，同時(shí)減少骨吸收水平，促進(jìn)骨質(zhì)重建和生成，而雌激素減少后不僅上述過(guò)程減弱，還促進(jìn)RANKL水平升高，促進(jìn)破骨細(xì)胞生長(zhǎng)分化，導(dǎo)致骨吸收增強(qiáng)，使骨強(qiáng)度下降，骨量降低[10]。近年來(lái)研究表明，腸道菌群失調(diào)能夠?qū)е鹿谴x異常，骨質(zhì)疏松癥患者糞便標(biāo)本中放線菌屬、蛋雞菌屬和梭狀芽孢桿菌屬豐度增加，不僅通過(guò)調(diào)控骨代謝和維生素D的吸收調(diào)控骨質(zhì)生長(zhǎng)，還能夠通過(guò)分泌瘦素、OPG等激素參與骨的代謝，是導(dǎo)致骨密度降低、骨脆性增加的重要因素[11-12]。

本研究結(jié)果顯示，研究組血清OC、BALP、TRACP-5b水平明顯升高，25(OH)D水平明顯降低，且腸道雙歧桿菌與25(OH)D水平呈正相關(guān)，與OC、BALP和TRACP-5b水平呈負(fù)相關(guān)，而腸桿菌則與25(OH)D水平呈負(fù)相關(guān)，與OC、BALP和TRACP-5b水平呈正相關(guān)，提示腸道菌群失調(diào)能夠引起骨代謝異常，可能是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的重要因素之一。

研究表明，RANKL/RANK/OPG通路與骨代謝密切相關(guān)，RANKL與RANK相結(jié)合后促進(jìn)c-Fos蛋白表達(dá)增多，與活化T淋巴細(xì)胞結(jié)合后促進(jìn)破骨細(xì)胞生成相關(guān)特異性基因表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化并抑制其凋亡，增強(qiáng)骨破壞進(jìn)程，使得骨吸收活性增強(qiáng)[13]。而OPG能夠競(jìng)爭(zhēng)性與RANK相結(jié)合，且結(jié)合能力較RANKL更強(qiáng)，從而有效阻止破骨細(xì)胞反應(yīng)的傳導(dǎo)，在破骨細(xì)胞形成和分化過(guò)程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用[14-16]。本研究結(jié)果顯示，研究組關(guān)節(jié)液中RANKL、RANK水平明顯升高，OPG水平明顯降低，提示腸道菌群可能通過(guò)調(diào)控RANKL/RANK/OPG通路減少OPG表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞生長(zhǎng)分化，有利于骨吸收和骨破壞的發(fā)展，可能是導(dǎo)致老年女性骨質(zhì)疏松的原因之一。

炎癥反應(yīng)也是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的重要原因，如通過(guò)增強(qiáng)免疫反應(yīng)、促進(jìn)氧化應(yīng)激、加劇炎癥反應(yīng)程度等途徑影響骨代謝微環(huán)境，促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖和分化促進(jìn)骨質(zhì)代謝，促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和進(jìn)展[17-18]。炎癥因子還能夠作用于成骨細(xì)胞，通過(guò)激活核因子κB等信號(hào)通路負(fù)性調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化、抑制Wnt/β-catenin通路抑制Sema3B蛋白表達(dá)等途徑抑制成骨細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[19-21]。本研究結(jié)果顯示,研究組血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平明顯高于對(duì)照組，提示腸道菌群失調(diào)可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥因子水平促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

綜上所述,腸道菌群失調(diào)的老年女性血清OC、BALP、TRACP-5b升高,25(OH)D水平降低，關(guān)節(jié)液內(nèi)RANKL、RANK蛋白表達(dá)增多，OPG蛋白表達(dá)減少，血清炎癥因子水平升高，促進(jìn)了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和進(jìn)展。本研究的不足之處在于樣本量較少，且納入研究的患者時(shí)間跨度較小，可能導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定程度的偏倚，需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以及研究時(shí)間跨度，以減少研究誤差，使研究結(jié)果更具有科學(xué)依據(jù)。