張鵬左東川牟思宇鐘宇彤袁小平曾錦

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，瀘州646000；

2.西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室，瀘州646000；

3.西南醫(yī)科大學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心血管醫(yī)學(xué)研究所，瀘州646000

基于干細(xì)胞的組織工程為組織的修復(fù)與再生提供了全新的思路[1-2]，但目前調(diào)節(jié)干細(xì)胞生物學(xué)特性的眾多分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚，嚴(yán)重阻礙了組織工程的研究進(jìn)展[3]。牙囊細(xì)胞是一種來(lái)源于牙囊組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，可分化形成牙周膜、牙骨質(zhì)和牙槽骨[4]。鑒于牙囊細(xì)胞在牙周組織分化發(fā)育中的特點(diǎn)、顯著的多向分化潛能以及在臨床上較易獲得，使其成為了一種值得考慮的種子細(xì)胞[5]。

鉀離子是機(jī)體內(nèi)重要的電解質(zhì)之一，是維持可興奮細(xì)胞靜息膜電位超極化的重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、分化、新陳代謝、滲透壓等生理功能具有廣泛的調(diào)控作用。內(nèi)向整流鉀（inward rectifier potassium，Kir）2.1通道蛋白屬于Kir家族，由KCNJ2基因編碼，是維持可興奮性細(xì)胞節(jié)律性、傳導(dǎo)性以及興奮性的主要鉀離子通道。生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度約為140 mmol·L-1，而細(xì)胞外鉀離子濃度約為4.5 mmol·L-1?？膳d奮細(xì)胞如心肌細(xì)胞等表達(dá)Kir2.1通道，鉀離子順著化學(xué)濃度差，經(jīng)Kir2.1通道介導(dǎo)，由細(xì)胞內(nèi)流向細(xì)胞外，從而維持細(xì)胞靜息膜電位超極化。Kir2.1通道調(diào)控細(xì)胞生理學(xué)功能的基礎(chǔ)在于其具有典型的內(nèi)向整流特性，其表現(xiàn)為從鉀平衡電位超極化的內(nèi)向電導(dǎo)增大，而去極化時(shí)外向電導(dǎo)減小，產(chǎn)生一個(gè)特征性的負(fù)斜率電導(dǎo)區(qū)，這一特性決定了其對(duì)細(xì)胞靜息膜電位超極化的維持[6]。Kir2.1的內(nèi)向整流特性對(duì)鉀離子濃度具有高度依賴性，當(dāng)細(xì)胞外鉀離子濃度升高時(shí)，電流-電壓曲線會(huì)沿電壓軸向右平移，產(chǎn)生跨交現(xiàn)象，外向電流不減小反而增大，導(dǎo)致細(xì)胞膜電位去極化[7]。已有研究表明，Kir2.1通道在非興奮性細(xì)胞也發(fā)揮了重要的作用。例如，Zhang等[8]報(bào)道，抑制Kir2.1通道的功能會(huì)引起晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞膜電位去極化，從而促進(jìn)細(xì)胞分化；Komarova等[9]以及Weidema等[10]報(bào)道Kir

2.1通道通過(guò)維持細(xì)胞膜電位的穩(wěn)定參與破骨細(xì)胞生理功能的調(diào)控。目前在間充質(zhì)干細(xì)胞上已發(fā)現(xiàn)包括鈣激活鉀通道、電壓門控鉀通道在內(nèi)的多種鉀通道，均有功能性的表達(dá)[11-12]，但目前Kir2.1通道在間充質(zhì)干細(xì)胞的生理功能尚不明確。本研究以人牙囊細(xì)胞（human dental follicle cell，hDFC）為研究對(duì)象，探討Kir2.1通道對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響及其機(jī)制，以期為應(yīng)用hDFC修復(fù)重建牙周組織提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

α-MEM低（高）糖培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco公司，美國(guó)），胰蛋白酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Ⅰ型膠原酶（合肥白鯊生物科技有限公司），青霉素-鏈霉素溶液、4%多聚甲醛固定液、成骨誘導(dǎo)液（Cyagen公司，美國(guó)），氯化銫（cesium chloride，CsCl）、4-甲氧基芐基-1-萘基甲基-胺鹽（ML133）（Abmole公司，美國(guó)），電解質(zhì)（Sigma公司，美國(guó)），堿性磷酸酶顯色和活性測(cè)定試劑盒、Trizol試劑、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），瓊脂糖（北京亞米生物科技有限公司），總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴(kuò)增試劑盒、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）試劑盒（Toyobo公司，日本）。成骨誘導(dǎo)液的組成成分為10%FBS、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、10 nmol·L-1地塞米松、50μg·mL-1抗壞血酸、10 nmol·L-1維生素D3。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2021-1118005）hDFC培養(yǎng)，所有研究對(duì)象知情同意。選取因正畸需要，于西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診部拔除的牙根發(fā)育未完全的第三磨牙牙胚中的牙囊組織，于無(wú)菌條件下，立刻收集于含有10%青霉素-鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中，在超凈工作臺(tái)中，用含有20%雙抗的PBS反復(fù)沖洗干凈，換干凈無(wú)菌剪剪碎成1 mm3的組織塊，收集于離心管中離心，去上清，加入1 mLⅠ型膠原酶于37℃恒溫水浴中消化30 min，消化期間每隔10 min適當(dāng)震蕩促使充分消化，消化完成后可見(jiàn)組織塊呈絮狀，再加入等量的含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液終止消化，離心，去上清，吸取組織塊均勻鋪于培養(yǎng)瓶底部，倒置，加入含有15%FBS的α-MEM培養(yǎng)液3 mL，30 min后翻瓶，于37℃、5%CO2的恒溫孵育箱中培養(yǎng)，大約培養(yǎng)5～7 d可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周圍爬出，通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞被分離擴(kuò)展用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hDFC的免疫表型，主要檢測(cè)hDFC與間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記物，包括CD73、CD90、CD105、CD31、CD45、CD3（上海艾博抗貿(mào)易有限公司），流式細(xì)胞術(shù)采用Beckman Coulter Cytomics FC 500 MPL系統(tǒng)（Beckman Coulter公司，美國(guó)）。

1.2.2 Kir2.1通道蛋白在hDFC中的表達(dá)情況 1）RT-PCR檢測(cè)Kir2.1的編碼基因KCNJ2在hDFC的表達(dá)：hDFC傳至第三代時(shí)，均勻接種于小皿中（密度為每孔2×104個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)細(xì)胞7 d后，使用Trizol法提取總RNA（試驗(yàn)中嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)酶操作），提取完成后，取1μL樣品使用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。采用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，用提取的RNA為模板，在冰浴中加入RT-PCR反應(yīng)混合物，反應(yīng)體系如下：緩沖液5μL，基因正向引物（10μmol·L-1）2μL，基因反向引 物（10μmol·L-1）2μL，逆 轉(zhuǎn) 錄 酶0.5μL，RNA酶抑制劑0.5μL，熱啟動(dòng)DNA聚合酶0.5μL，模板RNA 2μL，去RNA酶水37.5μL，反應(yīng)體系總共為50μL，在PCR儀上按下列條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件設(shè)定：45℃30 min、94℃5 min、（94℃30 s、60℃30 s、72℃1 min循環(huán)40次）、72℃10 min，反應(yīng)結(jié)束后取5～10μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2）RT-qPCR檢測(cè)Kir2.1在hDFC成骨誘導(dǎo)前后KCNJ2的基因表達(dá)量：hDFC傳至第三代時(shí)，均勻接種于小皿中（密度為每孔2×104個(gè)細(xì)胞），待細(xì)胞生長(zhǎng)到60%～70%時(shí)，分別對(duì)對(duì)照組（含10%FBS的α-MEM低糖培養(yǎng)基）和成骨誘導(dǎo)分化（osteogenic differentiation，OS）組（加入1.5 mL成骨誘導(dǎo)液的α-MEM低糖培養(yǎng)基）細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d換液1次，每次1.5 mL，第七天時(shí)，提取總RNA和測(cè)量其濃度及純度，取10μL變性，變性后的RNA通過(guò)一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），逆轉(zhuǎn)錄完成后加入等體積的ddH2O稀釋，通過(guò)RT-qPCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，根據(jù)公式F=2-ΔΔCT計(jì)算目的基因（KCNJ2）的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCT=（試驗(yàn)組目的基因平均CT值-試驗(yàn)組內(nèi)參基因平均CT值）-（對(duì)照組目的基因平均CT值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均CT值），其中目的基因KCNJ2的引物序列為：F5’-TGCCCGATTGCTGTTTTC-3’和R5’-GGCTGTCTTCGTCTATTT-3’。

1.2.3 膜片鉗技術(shù)檢測(cè)hDFC在成骨誘導(dǎo)分化前、后的細(xì)胞膜電位變化 hDFC傳至第三代時(shí)，在培養(yǎng)基中加入成骨誘導(dǎo)液對(duì)hDFC進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)7 d后，采用HEKA膜片鉗系統(tǒng)，在電流鉗模式下連續(xù)記錄細(xì)胞的膜電位。采用電阻為2～3 mΩ的玻璃電極，形成封接，破膜后進(jìn)行記錄。記錄hDFC膜電位的電極內(nèi)液各電解質(zhì)濃度為140 mmol·L-1氯化鉀、1 mmol·L-1氯化鎂、10 mmol·L-1乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸、1 mmol·L-1三磷酸腺苷二鉀鹽、5 mmol·L-1羥乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4），電極外液各電解質(zhì)濃度為135 mmol·L-1氯化鈉、5.4 mmol·L-1氯化鉀、2 mmol·L-1氯化鈣、1 mmol·L-1氯化鎂、15 mmol·L-1葡萄糖、10 mmol·L-1羥乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4）。所記錄電生理數(shù)據(jù)采用IgorPro軟件分析。

1.2.4 膜電位去極化或抑制Kir2.1通道功能對(duì)hDFC成骨分化的影響 實(shí)驗(yàn)分為：OS組（成骨誘導(dǎo)液），K+組（成骨誘導(dǎo)液+50 mmol·L-1鉀），CsCl組（成骨誘導(dǎo)液+10 mmol·L-1CsCl），ML133組（成骨誘導(dǎo)液+20μmol·L-1ML133）。

1）茜素紅染色及礦化結(jié)節(jié)定量分析：hDFC傳至第三代時(shí)，均勻種板于6孔板中（密度為每孔2×104個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到60%～70%時(shí)，去除基礎(chǔ)培養(yǎng)基，PBS輕柔清洗2～3次，各組細(xì)胞于37℃、5%CO2的孵育箱中避光培養(yǎng)，每3 d換液1次，每次1.5 mL，培養(yǎng)14 d后，吸取誘導(dǎo)液，PBS反復(fù)沖洗2～3次，吸干，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，再次用PBS反復(fù)輕柔沖洗2～3次，吸干，進(jìn)行茜素紅染色3 min，PBS沖洗多余染液，于搖床上輕微搖蕩10 min，更換為新PBS，于肉眼下觀察染色情況，并于顯微鏡下采圖，觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況，再行茜素紅染色半定量分析，向各組孔板中加入10%氯化十六烷基吡啶2 mL，充分混勻后，吸取100μL置于96孔板中，于562 nm處下檢測(cè)吸光度值。

2）堿性磷酸酶染色及活性測(cè)定：hDFC以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到60%～70%時(shí)，分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，每3 d換液1次，每次1.5 mL，第七天時(shí)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行堿性磷酸酶染色及活性測(cè)定，用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算堿性磷酸酶活性比。堿性磷酸酶活性的定量數(shù)據(jù)根據(jù)成骨分化第七天的對(duì)照結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)。

3）成骨分化相關(guān)基因[RUNX相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Runt related transcription factor，RUNX）2、骨鈣素（osteocalcin，OC）]的表達(dá)：hDFC傳至第三代時(shí)，均勻接種于小皿中（密度為每孔2×104個(gè)細(xì)胞），待細(xì)胞生長(zhǎng)到60%～70%時(shí)，分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，每3 d換液1次，14 d時(shí)同樣以上述1.2.2中的方法檢測(cè)和計(jì)算目的基因RUNX2、OCN的相對(duì)表達(dá)量，基因引物序列如下：RUNX2：F5’-GCAGCAGCAGCAGCAGGAG-3’和R5’-GCACCGAGCACAGGAAGTTGG-3’，OCN：F5’-GCCAGGCAGGTGCGAAGC-3’和R5’-GTCAGCCAACTCGTCACAGTCC-3’。

1.2.5 鈣離子成像檢測(cè)膜電位變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響 hDFC傳至第三代時(shí)，細(xì)胞均勻接種于小皿中的玻片上（密度為每孔2×104個(gè)細(xì)胞），于孵育箱中培養(yǎng)1 d，待hDFC貼壁于玻片上，用鈣離子熒光染料（Fura-2/AM）負(fù)載細(xì)胞30 min，然后用PBS沖洗掉剩余染料，將染色好的細(xì)胞玻片置于倒置顯微鏡載物臺(tái)檢測(cè)皿中，組裝好循環(huán)系統(tǒng)，通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)連續(xù)灌流標(biāo)準(zhǔn)（含5.4 mmol·L-1鉀）的細(xì)胞外液，然后用40倍油鏡觀察并選取hDFC，待hDFC細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)基線穩(wěn)定后，記錄胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度，再灌流含有低鉀（2 mmol·L-1）的細(xì)胞外液，觀察和記錄鈣信號(hào)的改變情況，其中鈣信號(hào)采用TILL vision軟件觀察和記錄2種波長(zhǎng)340 nm和380 nm激發(fā)下熒光強(qiáng)度的比值（F340/380），轉(zhuǎn)換頻率為0.2 Hz，發(fā)射光波長(zhǎng)為510 nm，曝光時(shí)間為5 ms。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析，P＜0.05時(shí)記為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hDFC的分離、培養(yǎng)及鑒定

hDFC經(jīng)原代培養(yǎng)5 d后，觀察可見(jiàn)已具有典型的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)，hDFC呈長(zhǎng)梭形，以放射狀或旋渦狀從組織塊向周圍生長(zhǎng)（圖1A）。利用酶消化法進(jìn)行分離純化后觀察可見(jiàn)，傳至第三代的hDFC形態(tài)均一，多呈長(zhǎng)梭形，呈魚群狀或放射狀排列（圖1B）。hDFC具有較強(qiáng)的成骨分化能力，成骨誘導(dǎo)14 d后經(jīng)茜素紅染色，鏡下觀察可見(jiàn)大量紅色礦物結(jié)節(jié)（圖1C）。流式細(xì)胞結(jié)果顯示：hDFC表面抗原CD73（97.93%）、CD90（99.96%）和CD105（82.98%）表達(dá)量高，而CD31（1.58%）、CD45（3.55%）和CD3（4.36%）表達(dá)量極低（圖2），證實(shí)培養(yǎng)獲得的hDFC為間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞。

圖1 hDFC培養(yǎng)及鑒定 ×40Fig 1 Cultivation and identification of hDFCs ×40

圖2 細(xì)胞表面抗原表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果Fig 2 Results of cell surface antigen expression by flow cytometry

2.2 Kir2.1通道蛋白在hDFC中的表達(dá)情況

RT-PCR結(jié)果顯示：hDFC表達(dá)Kir2.1基因KCNJ2（圖3A）；RT-qPCR結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞相比較，OS組細(xì)胞的Kir2.1基因KCNJ2的表達(dá)上調(diào)（圖3B）。

圖3 Kir2.1基因KCNJ2的表達(dá)情況Fig 3 KCNJ2 expression of Kir2.1 channel

2.3 成骨誘導(dǎo)前后hDFC的膜電位變化

全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)前hDFC的膜電位約為（-12±3.2）mV，成骨誘導(dǎo)后的膜電位約為（-47±5.2）mV（圖4），這一結(jié)果說(shuō)明，hDFC成骨分化的過(guò)程中伴隨著細(xì)胞膜電位超極化的發(fā)生。

圖4 hDFC成骨誘導(dǎo)前后的膜電位變化Fig 4 Membrane potential changes of the hDFCs before and after osteogenic induction

2.4 膜電位去極化或抑制Kir2.1通道功能對(duì)hDFC成骨分化的影響

茜素紅染色及礦化結(jié)節(jié)定量分析結(jié)果顯示：經(jīng)成骨誘導(dǎo)14 d后，OS組細(xì)胞鏡下觀察可見(jiàn)大量紅色礦物結(jié)節(jié)，而K+組、CsCl組和ML133組細(xì)胞的紅色礦物結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少。肉眼觀察結(jié)果見(jiàn)圖5A～D；鏡下觀察結(jié)果見(jiàn)圖5E～H，茜素紅染色半定量分析見(jiàn)圖6。

圖5 茜素紅染色結(jié)果 ×40Fig 5 Resultsof alizarin red staining ×40

圖6 茜素紅染色半定量分析結(jié)果Fig 6 Semi-quantitative analysis result of alizarin red staining

堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示：經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d后，與OS組細(xì)胞相比較，K+組CsCl組和ML133組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性明顯降低，肉眼觀察結(jié)果見(jiàn)圖7A～D，鏡下觀察結(jié)果見(jiàn)圖7E～H，堿性磷酸酶活性測(cè)定分析結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖7 堿性磷酸酶染色結(jié)果 ×40Fig 7 Resultsof alkalinephosphatasestaining ×40

圖8 堿性磷酸酶活性測(cè)定結(jié)果Fig 8 Activity measurement results of alkalinephosphatase

2.5 成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)情況

RT-qPCR結(jié)果顯示：經(jīng)成骨誘導(dǎo)14 d后，與OS組細(xì)胞相比較，K+組、CsCl組、ML133組細(xì)胞的RUNX2、OCN基因表達(dá)明顯降低（圖9）。

圖9 RT-qPCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因RUNX2、OCN的表達(dá)情況Fig 9 Detection of osteogenic differentiation-related genes RUNX2 and OCN expression by RT-qPCR

2.6 膜電位超極化對(duì)hDFC胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

鈣離子成像結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞外鉀離子的濃度從5.4 mmol·L-1降為2 mmol·L-1時(shí)，hDFC胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（圖10），F(xiàn)340/380的比值見(jiàn)圖11，上述結(jié)果表明，膜電位超極化會(huì)引起hDFC胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。

圖10 鈣離子熒光染色結(jié)果 ×40Fig 10 Results of calcium ion fluorescent staining ×40

圖11 F340/380比值的分析結(jié)果Fig 11 The analysis result of F340/380 ratio

3 討論

自2005年Morsczeck等[13]從人的牙囊組織中首次分離出hDFC以來(lái)，該細(xì)胞因其較好的干細(xì)胞特性以及再生牙周組織的潛力而受到廣泛關(guān)注。

本研究中的hDFC提取于因正畸需要而拔除的健康第三磨牙牙胚，經(jīng)原代培養(yǎng)后具有典型的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物，證明其為純化的間充質(zhì)干細(xì)胞。hDFC是來(lái)源于牙囊組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有較強(qiáng)的成骨分化潛能，本研究培養(yǎng)獲得的hDFC在成骨誘導(dǎo)后，經(jīng)茜素紅染色可見(jiàn)大量的成骨礦化結(jié)節(jié)，這與以往相關(guān)的報(bào)道[14]一致。

有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過(guò)程受細(xì)胞膜電位的調(diào)控。例如，Kirkham等[15]報(bào)道，通過(guò)電刺激的方法使人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜電位超極化能夠促進(jìn)細(xì)胞成骨分化；Sundelacruz等[16]和Bhavsar等[17]報(bào)道，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨分化的過(guò)程中伴隨著膜電位的超極化，并且他們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)提高細(xì)胞外鉀離子的濃度使細(xì)胞膜電位去極化，能夠抑制細(xì)胞的成骨分化過(guò)程。本研究中，首先檢測(cè)了hDFC成骨分化過(guò)程中膜電位的變化；膜片鉗結(jié)果顯示，細(xì)胞成骨誘導(dǎo)前的膜電位約為（-12±3.2）mV，經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d后，膜電位約為（-47±5.2）mV，這一結(jié)果說(shuō)明，hDFC成骨分化的過(guò)程中伴隨著膜電位的超極化；其次，觀察了膜電位去極化對(duì)hDFC成骨分化的影響，提高細(xì)胞外鉀離子的濃度是使細(xì)胞膜電位去極化常用的方法[16]。

本研究結(jié)果顯示，OS組細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后可見(jiàn)大量礦化結(jié)節(jié)，而提高細(xì)胞外鉀離子的濃度后，細(xì)胞的成骨礦化能力顯著降低。上述結(jié)果說(shuō)明，細(xì)胞膜電位超極化的發(fā)生在hDFC成骨分化的過(guò)程中起到了重要的作用。

Kir2.1通道蛋白在興奮性細(xì)胞發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，但近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)顯示，Kir2.1通道蛋白在非興奮性細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、多能干細(xì)胞等也發(fā)揮了重要的作用。如Kito等[18]報(bào)道，Kir2.1通道蛋白的表達(dá)上調(diào)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡過(guò)程中起到了重要的作用；Gattlen等[19]報(bào)道，抑制Kir2.1通道蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，能夠抑制細(xì)胞的增殖能力從而減輕神經(jīng)痛。

Pini等[20]發(fā)現(xiàn)，Kir2.1通道功能的喪失影響多能干細(xì)胞成骨和軟骨形成過(guò)程。在本研究中，通過(guò)RT-PCR的方法首先證明了hDFC表達(dá)Kir2.1，并且成骨誘導(dǎo)后Kir2.1的基因表達(dá)量明顯上調(diào)；其次，應(yīng)用Kir2.1通道選擇性阻斷劑（CsCl）和特異性阻斷劑（ML133）都證明了抑制Kir2.1通道的功能能夠抑制hDFC的成骨礦化能力。因此，根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道以及本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明了Kir2.1通道蛋白介導(dǎo)的膜電位超極化在hDFC成骨分化的過(guò)程中起到了關(guān)鍵的作用。Kirkham等[15]和Pchelintseva等[21]在人間充質(zhì)干細(xì)胞的研究表明，膜電位超極化可以引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高繼而調(diào)控成骨分化，本研究中確實(shí)發(fā)現(xiàn)膜電位超極化能夠引起hDFC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，這一結(jié)果與以往在間充質(zhì)干細(xì)胞的研究相一致。

牙槽骨缺損的修復(fù)、再生一直是牙周組織工程研究的熱點(diǎn)，牙囊細(xì)胞作為牙周組織工程的種子細(xì)胞，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特征，表現(xiàn)出強(qiáng)大的多向分化能力及再生能力[22]，是骨缺損修復(fù)值得考慮的種子細(xì)胞。有學(xué)者[23]報(bào)道Kir2.1通道蛋白的功能與成骨密切相關(guān)，基因突變導(dǎo)致的Kir2.1功能喪失，臨床上會(huì)出現(xiàn)安德森綜合征，臨床表現(xiàn)之一為骨骼發(fā)育異常[20]。本研究的研究結(jié)果也表明抑制Kir2.1通道蛋白的功能可以抑制hDFC成骨分化。在將來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，可針對(duì)Kir2.1通道蛋白這一靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，從而為促進(jìn)骨缺損的修復(fù)、再生提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。