李欣容

鄭州市疾病預(yù)防控制中心地方病防治科，河南 鄭州 450007

艾滋病是一種獲得性疾病，又被稱作獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）［1］。上世紀(jì)80年代初，發(fā)現(xiàn)世界上第一批AIDS 病例，這種疾病成為近代歷史上最具破壞性的傳染病之一，40多年后其臨床診治仍然面臨許多挑戰(zhàn)［2］。根據(jù)聯(lián)合國AIDS 規(guī)劃署的數(shù)據(jù)，2019 年，全球有3 800 萬人感染了人體免疫缺陷病毒（human immune deficiency virus，HIV），69 萬人死于與AIDS 有關(guān)的疾?。?］。其病原體是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，現(xiàn)在被稱為HIV-1，盡管抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法取得了進展，大幅提高了患者的預(yù)期壽命［4］，將AIDS 從一種致命疾病轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N慢性病，但這一疾病仍然是全世界面臨的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)［5-6］。趨化因子CXCL8 也被稱為白細(xì)胞介素8（IL-8），屬于谷氨酸-亮氨酸-精氨酸趨化因子，一般由巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。CXCL8作為炎癥介質(zhì)，參與多種慢性炎癥疾病。在細(xì)菌感染中，CXCL8 會導(dǎo)致白細(xì)胞，特別是中性粒細(xì)胞募集到炎癥和組織損傷部位來對抗病原體［7］。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3）是叉頭/翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，表達于淋巴細(xì)胞，免疫細(xì)胞研究表明FOXP3 對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的發(fā)育和功能至關(guān)重要［8］。此外，在正常條件下和侵襲性癌（包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌）發(fā)生期間，F(xiàn)OXP3 也可在人體組織的上皮細(xì)胞中表達［9］。但二者在AIDS患者血清中的表達如何，是否具有相關(guān)性的臨床研究較少。因此，本研究通過檢測AIDS患者血清中CXCL8、FOXP3表達，探討二者在AIDS 中的作用及關(guān)系，初步討論其可能的潛在價值和臨床意義。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取2018 年5 月—2021 年5 月到鄭州市疾病預(yù)防控制中心就診的72 例AIDS 患者為艾滋組，年齡20～ 62 歲，其中男51 例，女21 例，平均年齡（29.65±10.74）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《艾滋病診療指南第三版（2015 版）》［10］中對AIDS 的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有長期使用免疫抑制劑和皮質(zhì)類固醇激素等藥物者；（2）有惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能障礙等疾病者；（3）合并其他免疫系統(tǒng)疾病者；（4）有先天性精神障礙、智力障礙者；（5）臨床資料不完整者。選取同期體檢的健康患者60 例為對照組，年齡18～60歲，其中男35例，女25例，平均年齡（31.55 ± 11.81）歲。本研究所有樣品采集均取得受試者知情同意，并經(jīng)我院道德倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 人CXCL8 ELISA試劑盒（貨號：ab214030）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；DxFLEX流式細(xì)胞儀購自貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；Trizol 裂解劑購自上海晶抗生物工程有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)儀購自上海測博生物科技發(fā)展中心；熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒購自上海欽誠生物科技有限公司；核酸微量分析儀購自北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1.2.2 標(biāo)本采集 觀察組患者于入院次日清晨抽取空腹靜脈血5 mL，對照組患者于體檢當(dāng)日抽取空腹靜脈血5 mL，離心處理后取上層血清置于-80℃液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 臨床資料收集及生化指標(biāo)測定 收集所有研究對象的臨床資料，分別記錄年齡、性別；采用流式細(xì)胞儀檢測T 淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平；免疫比濁法測定患者血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA水平。

1.2.4 qRT-PCR 法檢測血清中FOXP3 mRNA 水平 取血清標(biāo)本500 μL，加入Trizol 試劑提取總RNA。采用核酸微量分析儀檢測RNA 濃度以及純度。取1 μg 總RNA 作為模板進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后采用實時定量PCR 儀進行擴增。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；60 ℃，20 s；70 ℃，10 s，共設(shè)40 個循環(huán)，所有條件均按照檢測系統(tǒng)嚴(yán)格進行。采用2-ΔΔCT法對血清FOXP3 mRNA 表達水平進行定量分析。FOXP3 mRNA及內(nèi)參18S的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA 法）檢測血清中CXCL8 水平 具體操作步驟按照ELISA 試劑盒說明書檢測各組血清中CXCL8表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用“%”表示，行卡方（χ2）檢驗；計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，行t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較利用單因素方差分析；采用Pearson 法分析CXCL8 與FOXP3 表達的相關(guān)性。利用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評價血清CXCL8、FOXP3 水平對艾滋病的診斷價值。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

對照組和艾滋組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。艾滋組中患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平均低于對照組，IgG、IgM、IgA 水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 艾滋組和對照組血清中CXCL8 和FOXP3 mRNA水平比較

艾滋組患者血清中CXCL8 表達水平高于對照組，F(xiàn)OXP3 mRNA 表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組血清中CXCL8、FOXP3 mRNA水平比較（）

表3 兩組血清中CXCL8、FOXP3 mRNA水平比較（）

2.3 AIDS 患者血清CXCL8 和FOXP3 mRNA 水平與T淋巴細(xì)胞亞群和免疫球蛋白水平的相關(guān)性分析

AIDS 患者血清CXCL8 水平與CD4+、CD8+、CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與IgG、IgM、IgA 呈正相關(guān)（P＜0.05），F(xiàn)OXP3 mRNA 水平與CD4+、CD8+、CD4+/CD8+呈正相關(guān)（P＜0.05），與IgG、IgM、IgA呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表4。

表4 AIDS患者血清CXCL8和FOXP3 mRNA水平與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 AIDS 患者血清中CXCL8 和FOXP3 mRNA 表達的相關(guān)性

Pearson 法分析結(jié)果顯示，艾滋病患者血清中CXCL8、FOXP3 mRNA 表達呈明顯負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.350，P＜ 0.05），見圖1。

圖1 AIDS患者血清中CXCL8和FOXP3 mRNA表達相關(guān)性分析

2.5 血清中CXCL8水平對AIDS患者的診斷價值

血清CXCL8 水平預(yù)測AIDS 的曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）分別為0.934（95%CI：0.877～ 0.970），如圖2。血清CXCL8 水平臨界值為6.24 μg/L，其對應(yīng)Youden＇s 指數(shù)最大（0.844），對應(yīng)的敏感度分別為86.11%，特異度為98.33%。見表5。

圖2 血清CXCL8、FOXP3 mRNA水平診斷AIDS患者的ROC曲線

表5 血清中CXCL8水平對AIDS的診斷結(jié)果（例）

2.6 血清中FOXP3 mRNA 水平對AIDS 患者的診斷價值

血清FOXP3 mRNA水平預(yù)測AIDS的AUC分別為0.975（95%CI：0.932～ 0.994），見圖2。血清FOXP3 mRNA 水平臨界值為2.79，其對應(yīng)Youden＇s指數(shù)最大（0.908），對應(yīng)的敏感度為95.83%，特異度為95.00%，見表6。

表6 血清中FOXP3 mRNA水平對AIDS的診斷結(jié)果（例）

2.7 血清中CXCL8、FOXP3二者聯(lián)合對AIDS 患者的診斷價值

血清CXCL8 水平≥6.24 μg/L、血清FOXP3 mRNA水平≥2.79任意一項結(jié)果為陽性，則判斷聯(lián)合診斷結(jié)果為陽性，反之為陰性。結(jié)果顯示血清CXCL8、FOXP3 水平聯(lián)合預(yù)測AIDS 患者的AUC 為0.981（95%CI：0.940～ 0.997），見圖2。敏感度為98.61%，特異度為91.67%，見表7。

表7 二者聯(lián)合對AIDS的診斷結(jié)果（例）

3 討論

AIDS 屬于免疫衰竭疾病，感染HIV 后會使患者免疫功能出現(xiàn)異常［11］，該病主要通過性傳播、經(jīng)皮傳播和圍產(chǎn)期傳播。若患者未及時接受有效治療，病死率極高［12］。自從大約40 年前首次發(fā)現(xiàn)艾滋病毒以來，HIV-1 的大流行已經(jīng)感染了至少6 000 萬人，造成2 500 多萬人死亡，發(fā)展中國家的AIDS 發(fā)病率和死亡率最高。雖然醫(yī)學(xué)界已經(jīng)對AIDS 進行了大量研究，但依然沒有有效的疫苗可以預(yù)防AIDS，如果可以在疾病早期作出準(zhǔn)確判斷，可以顯著減少疾病感染率和死亡率［13］。

CXCL8是炎癥的生物標(biāo)志物，可被促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α 和白細(xì)胞介素1β 迅速誘導(dǎo)。與其他炎癥因子類似，CXCL8負(fù)責(zé)將中性粒細(xì)胞和其他粒細(xì)胞募集，激活炎癥部位。通常，CXCL8 在正常組織中的表達較低或無法檢測到，在癌癥中，CXCL8作為一種重要的多功能細(xì)胞因子，通過自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［14-15］，如黑色素瘤、宮頸癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌和胃癌以及血液系統(tǒng)惡性腫瘤（如急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等），均顯示CXCL8的表達增加［16］。本研究中AIDS 患者血清中CXCL8 表達水平高于對照組；艾滋組中患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均低于對照組，IgG、IgM、IgA 均高于對照組；艾滋病患者血清CXCL8 水平與CD4+、CD8+、CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)，與IgG、IgM、IgA 呈正相關(guān)；ROC曲線顯示，血清CXCL8水平預(yù)測AIDS的曲線下面積為0.934（95%CI：0.877～0.970），對應(yīng)的敏感度為86.11%，特異度為98.33%，表明CXCL8參與AIDS 的發(fā)生且可在一定程度上對AIDS 進行診斷。

FOXP3是叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子家族的一種，可在調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞中特異性表達。Treg 細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞的一個亞群，在維持免疫平衡等方面有重要作用。HIV/AIDS 疾病進展與人體免疫功能密切相關(guān)，在HIV-1感染時，Treg可以通過降低免疫應(yīng)答以及免疫活化在疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［17］。陳秀英等［18］發(fā)現(xiàn)AIDS 患者經(jīng)過HAART治療可以降低FOXP3 mRNA的表達，使Treg的數(shù)量和功能得到控制。本研究中，AIDS患者血清FOXP3水平低于對照組。研究進一步發(fā)現(xiàn)，血清中CXCL8與FOXP3表達水平呈明顯負(fù)相關(guān)；FOXP3 mRNA水平與CD4+、CD8+、CD4+/CD8+呈正相關(guān)，與IgG、IgM、IgA 呈負(fù)相關(guān)；ROC 結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP3 水平預(yù)測AIDS的曲線下面積為0.975（95%CI：0.932～0.994），對應(yīng)的敏感度為95.83%，特異度為95.00%，與CXCL8 二者聯(lián)合預(yù)測AIDS 患者的AUC為0.981（95%CI：0.940～ 0.997），敏感度為98.61%，特異度為91.67%。提示二者共同參與AIDS 的發(fā)生發(fā)展，可作為評估AIDS 發(fā)生的潛在指標(biāo)。

綜上所述，CXCL8 在AIDS 患者血清中呈現(xiàn)高表達，F(xiàn)OXP3呈低表達，二者呈顯著負(fù)相關(guān)，提示二者參與AIDS的發(fā)生、發(fā)展，CXCL8與FOXP3可作為AIDS的早期診斷及病情評估的生物學(xué)指標(biāo)，具有重要的臨床意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突