李 璐 劉雨晴 張樹鵬 丁寶琪

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東濟(jì)南 250117；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，山東泰安 271000

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是侵襲性淋巴瘤中最大的一類，亦是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin＇s lymphoma，NHL）最常見的病理類型，約占NHL 的30%～ 40%，其在形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和臨床表現(xiàn)等方面存在較大的異質(zhì)性，預(yù)后亦大不相同。根據(jù)形態(tài)學(xué)、分子及免疫表型，分為不同的變型及亞組，其中被廣泛接受的是HANS 法，即CD10+，或CD10-/BCL-6+/MUM1-為GCB 免疫表型；其余為non-GCB。其中各標(biāo)記30%以上細(xì)胞著色確定為陽性界值。

腫瘤細(xì)胞表達(dá)B 細(xì)胞抗原標(biāo)記物（CD19、CD20、PAX-2、CD79a），部分表達(dá)生發(fā)中心CD10 及BCL-6、生發(fā)中心后標(biāo)記MUM1及BCL-2；ki-67指數(shù)可達(dá)40%～90%；少數(shù)表達(dá)CD5、CD21、CD30，其中CD5+DLBCL 的免疫組化亞型，由日本人最先報(bào)道，后來也被WHO所承認(rèn)。這些少數(shù)比例的特殊免疫表型的表達(dá)，在日常診斷，特別是在小活檢的診斷中給病理醫(yī)生帶來極大的困惑及困難，本研究即分析CD5+、CD21+DLBCL 的病理及臨床特征，為DLBCL 的明確診斷與可能存在的分子治療靶點(diǎn)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收錄2015 年1 月1 日—2017 年12 月31 日山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院診治的DLBCL 初發(fā)患者。收集納入研究對(duì)象的臨床及病理資料，包括年齡、性別、病理分型、臨床分期、B 癥狀（發(fā)熱、乏力、消瘦和盜汗等全身癥狀）、累及部位。以2016 年WHO淋巴瘤分類標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)［1］，免疫組化復(fù)查相關(guān)腫瘤細(xì)胞免疫學(xué)表型標(biāo)志；臨床分期按照改良Ann Arbor分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

使用組織芯片制作儀將62 例患者蠟塊做成組織芯片，并常規(guī)切片，行HE 及免疫組織化學(xué)染色。組織芯片制作方法：收集本實(shí)驗(yàn)62 例患者蠟塊，在鏡下標(biāo)出HE 切片中的病變區(qū)域，使用打孔器將標(biāo)記好的組織9 個(gè)一組排列在空白蠟塊上，使用切片機(jī)對(duì)陣列蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片獲得組織芯片，見圖1，2。免疫組化染色使用全自動(dòng)免疫組化染色儀，型號(hào)：徠卡BOND-MAX。單克隆抗體CD5（1∶100）、CD20（1∶200）購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，CD5 克隆號(hào)：SP19，CD21 克隆號(hào)：EP64，實(shí)驗(yàn)以正常淋巴組織作為陰性對(duì)照。CD5、CD21 陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜，陽性產(chǎn)物呈淡黃色至棕黃色顆粒狀［2］。每張切片由3 位病理醫(yī)師進(jìn)行復(fù)閱，以大于30%的腫瘤細(xì)胞中、強(qiáng)度著色為陽性，小于30%視為陰性。如有不一致，經(jīng)重新審閱討論達(dá)成共識(shí)。

圖1 組織陣列蠟塊

圖2 組織陣列HE切片

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法檢驗(yàn)兩組之間的相關(guān)性；用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，并使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)比較差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

CD5、CD21 陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜，陽性產(chǎn)物呈淡黃色至棕黃色顆粒狀，本試驗(yàn)以大于30%的腫瘤細(xì)胞中、強(qiáng)度著色為陽性。62 例DLBCL 患者中，CD5陽性患者9例，CD21陽性患者15例，CD5、CD21均陽性患者2例，CD5、CD21均陰性患者40例，CD5陽性、CD21 陰性患者7 例，CD5 陰性、CD21 陽性患者13例。見圖3～6。

圖3 IHC：CD5中度陽性（×100）

圖4 IHC：CD5強(qiáng)度陽性（×200）

圖5 IHC：CD21中度陽性（×200）

圖6 IHC：CD21強(qiáng)度陽性（×200）

2.1 DLBCL組織CD5表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

將62 例DLBCL 患者分為CD5 陽性組、CD5 陰性組；發(fā)病中位年齡66 歲（17～ 88 歲）；9 例CD5陽性，比例為14.52%（9/62），53 例CD5 陰性，比例為85.48%（53/62），見表1。CD5 陽性組≤66 歲者占88.89%（8/9），男性占88.89%（8/9），兩組年齡性別之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD5陽性組44.44%（4/9）伴有B 癥狀，Ann Arbor 分期Ⅲ～ Ⅳ期者占88.89%（8/9），均高于CD5 陰性組（P＜0.05）。CD5 陽性組患者77.78%（7/9）伴有結(jié)外侵犯，22.22%（2/9）僅局限于結(jié)內(nèi)，結(jié)外侵犯發(fā)生率高于CD5 陰性組，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0698）。62 例患者按照Hans 分型分類，生發(fā)中心起源B 細(xì)胞亞型GCB 型占22.58%（14/62），non-GCB 型占77.42%（48/62），CD5 陽性組GCB 型占7.14%（1/14），non-GCB 型占16.67%（8/48），與CD5 陰性組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.668 7）。

表1 DLBCL組織CD5表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系［n（%）］

2.2 DLBCL 組織CD21 表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

將62 例DLBCL 患者分為CD21 陽性組、CD21陰性組；發(fā)病中位年齡66 歲（17～ 88 歲）；15 例CD21 陽性，比例為24.19%（15/62），47 例CD21 陰性，比例為75.81%（47/62），見表2。CD21陽性組≥66 歲者 占17.74%（11/62），＜66 歲 者占6.45%（4/62），與CD21 陰性組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.038 0）。但兩組在性別、病理分型、臨床分期、B 癥狀、累及部位之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 DLBCL組織CD21表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系［n（%）］

2.3 DLBCL組織CD5表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

CD5陽性組中位生存時(shí)間為30個(gè)月，CD5陰性組因隨訪時(shí)間短，無法得出中位生存時(shí)間。由Kaplan-Meier 得出，與CD5陰性組患者比較，CD5陽性組患者無進(jìn)展生存時(shí)間（progression-free survival，PFS）較低，而且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012），見圖7。

圖7 DLBCL組織CD5表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

2.4 DLBCL組織CD21表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

CD21 陰性組中位生存時(shí)間為60 個(gè)月，CD21陽性組因隨訪時(shí)間短，無法得出中位生存時(shí)間。由Kaplan-Meier 得出，與CD21 陽性組患者比較，CD21 陰性組患者PFS 較低，而且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012），見圖8。

圖8 DLBCL組織CD21表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

2.5 各組間CD5、CD21 表達(dá)與臨床病理特征及生存時(shí)間的關(guān)系

將CD5、CD21 均陽性組，CD5、CD21 均陰性組，CD5 陽性CD21 陰性組，CD5 陰性CD21 陽性組的臨床病理特征及生存時(shí)間分別進(jìn)行比較，見表3。綜合組內(nèi)、組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果，得出CD5 陽性DLBCL 好發(fā)于男性，初診時(shí)侵犯淋巴結(jié)外、臨床分期多為Ⅲ～Ⅳ期，生存期較短；CD21 陽性DLBCL 相對(duì)于陰性組生存期較長(zhǎng)，初診時(shí)侵犯淋巴結(jié)內(nèi)。

表3 各組間CD5、CD21表達(dá)與臨床病理特征及生存時(shí)間的關(guān)系（P）

3 討論

CD5 抗原是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為67× 103，可激活多種細(xì)胞通路。大部分表達(dá)于正常成熟T 細(xì)胞，小部分表達(dá)于外周B 細(xì)胞［3］。正常情況下，CD5主要表達(dá)于胎兒肝臟、脾臟及成人腹膜、腸系膜和扁桃體等處［4-6］。在正常機(jī)體內(nèi)，CD5陽性的B淋巴細(xì)胞能夠自我更新保持平衡，并通過B細(xì)胞受體與一些配基相互作用，刺激細(xì)胞增生避免凋亡，若這個(gè)平衡被打破，則可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［6］。在成熟B 細(xì)胞腫瘤中，CD5 在大多數(shù)慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤（CLL/SLL）和套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）患者中表達(dá)，但在DLBCL患者中表達(dá)較少，僅在少數(shù)邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤患者中表達(dá)［7］。關(guān)于CD5介導(dǎo)B 細(xì)胞存活的機(jī)制，BCR 依賴通路［8］和獨(dú)立信號(hào)通路［9］研究較為深入。在BCR 依賴通路中，CD5 參與正常B細(xì)胞BCR介導(dǎo)的程序性死亡的負(fù)反饋，從而通過預(yù)防腫瘤凋亡導(dǎo)致DLBCL 的不良預(yù)后。在獨(dú)立信號(hào)通路中，更關(guān)注的是白細(xì)胞介素-10（IL-10）的水平，CD5+B 細(xì)胞的IL-10 水平比CD5-B 細(xì)胞的水平更高。IL-10能直接促進(jìn)B細(xì)胞的生存，進(jìn)而有可能支持CD5相關(guān)淋巴瘤細(xì)胞的生存。

各種研究表明，原發(fā)CD5+DLBCL 預(yù)后差，CD5陽性DLBCL與幾個(gè)臨床病理特征有關(guān)，這些臨床病理特征可能導(dǎo)致DLBCL 預(yù)后較差［10-13］。CD5 陽性DLBCL 容易發(fā)生在老年女性、更頻繁的B 癥狀、累及淋巴結(jié)外器官的患者［14-15］。

CD21主要存在于樹突狀細(xì)胞表面、B淋巴細(xì)胞和鼻咽上皮細(xì)胞表面，分子量為145 kd，在星形膠質(zhì)細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中也有表達(dá)。在B細(xì)胞分化中，CD21表達(dá)晚于CD19和CD20［16］，在早期B淋巴細(xì)胞中被激活，在仍表達(dá)CD19 和CD20 的活化B 細(xì)胞中消失［17］。有關(guān)研究指出，CD21 陽性的DLBCL 中大多為GCB DLBCL，預(yù)后較其它亞型要好［18］。

本研究對(duì)62例DLBCL患者的臨床病理特征進(jìn)行對(duì)比分析，中位年齡66歲，小于66歲患者31例，占比50%（31/62）；男性患者33例，占比53.23%（33/62）；Ⅰ～Ⅱ期患者32 例，占比51.61（32/62）；伴有B 癥狀患者9 例，占比14.52（9/62）；侵犯結(jié)外部位患者29例，占比46.77（29/62）；non-GCB患者48例，占比77.42（48/62）；CD5 陽性患者9 例，比例為14.52%（9/62），稍高于之前研究報(bào)道的5%～10%［19］；CD21陽性患者15 例，比例為24.19%（15/62）。CD5 陽性DLBCL 好發(fā)于男性，初診時(shí)侵犯淋巴結(jié)外，臨床分期多為Ⅲ～Ⅳ期，生存期較短；CD21陽性DLBCL相對(duì)于陰性組生存期較長(zhǎng)，初診時(shí)侵犯淋巴結(jié)內(nèi)。

本研究結(jié)果與之前的研究并未完全達(dá)成一致。唐慧芬等［20］研究的139例DLBCL 病例中，中位年齡58 歲，小于58 歲患者59 例，占比42.45%（59/139）；Ⅰ～Ⅱ期患者31 例，占比22.30%（31/139）；伴有B癥狀患者82例，占比58.99%（82/139）；研究結(jié)果顯示，CD5 陽性患者多出現(xiàn)在老年女性，表現(xiàn)出較高的IPI 評(píng)分，骨髓受累，ECOG 評(píng)分大于1 分，non-GCB亞型，生存期相比CD5陰性患者顯著更短。姚偉凱［21］研究的80例DLBCL病例中，中位年齡60歲，小于60 歲患者37 例，占比46.25%（37/80）；男性患者39例，占比48.75%（39/80）；Ⅰ～Ⅱ期患者26例，占比32.50%（26/80）；伴有B 癥狀患者38 例，占比47.50%（38/80）；侵犯結(jié)外部位患者65 例，占比81.25%（65/80）；non-GCB 患者52 例，占比65.00（52/80）；CD21 陽性者25 例，占比21.25%；研究結(jié)果顯示，CD21 陽性患者發(fā)病年齡低，臨床分期早，結(jié)外受累少，生存期較CD21陰性患者長(zhǎng)。

通過對(duì)比之前的研究與本次研究發(fā)現(xiàn)結(jié)果的差異可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)：①CD5、CD21判定為陽性的腫瘤細(xì)胞比例并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，以往的研究中CD5、CD21判讀為陽性的腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)占總腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)比例為10%到30%不等，本次研究中采用的比例為30%；②由于地域差異以及數(shù)據(jù)來源不同導(dǎo)致的病例構(gòu)成比例相差較大，以往的研究中Ⅲ～Ⅳ期、侵犯結(jié)外器官以及伴有B癥狀的患者比例均大于50%，高于本次研究中的比例；③本次是單中心研究，實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少，隨訪時(shí)間較短。

本研究62 例DLBCL 患者中，CD5 陽性表達(dá)者9 例（14.52%），CD21 陽性表達(dá)者15 例（24.19%），CD5 表達(dá)陽性的DLBCL 患者的預(yù)后較差；CD21 表達(dá)陽性的DLBCL 患者的預(yù)后較好?？赏ㄟ^CD5、CD21 的表達(dá)狀況對(duì)DLBCL 患者診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療方案的選擇提供參考，也為新的治療靶點(diǎn)的開發(fā)積累了進(jìn)一步的客觀依據(jù)。同時(shí)，CD5 及CD21 陽性DLBCL 比例的進(jìn)一步明確，也為臨床醫(yī)生在小活檢標(biāo)本的診斷中，提供重要的參考價(jià)值。希望在以后的工作中，能積累更多的病例，進(jìn)行更深入的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突