劉兆龍，張濱，楊樂（.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院普外科，上海 20203；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 00005；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 蘇州 2523）

乳腺癌已成為中國女性發(fā)病率最高、病死率位居第五的惡性腫瘤[1-2]。近年來，雖然針對乳腺癌治療進(jìn)行了大量的研究，包括早期診斷、手術(shù)切除、靶向治療和聯(lián)合治療等，但中晚期乳腺癌患者5年生存率仍然低于30%，其中三陰性乳腺癌患者5年生存率低于15%[3-7]。缺乏有效治療靶點和高轉(zhuǎn)移性是臨床上乳腺癌治療面臨的關(guān)鍵問題。乳腺癌中癌基因的異常高表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素，因此，闡明乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制、發(fā)掘潛在的新靶點是乳腺癌靶向治療的有效策略。纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域蛋白（fibronectin Ⅲdomain containing protein，F(xiàn)NDC）在組織發(fā)育和細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮多種功能[8]，已有研究[9-12]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC蛋白家族成員參與腫瘤惡性進(jìn)展。而FNDC10，也稱為C1orf233，目前尚少見關(guān)于該基因功能的文獻(xiàn)報道。本研究檢測FNDC10 在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，研究FNDC10在乳腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移中的作用，并探討其作用機(jī)制，以期為乳腺癌早期診斷和靶向治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

正常永生化乳腺細(xì)胞MCF-10A 和乳腺癌細(xì)胞（MCF-7、MDA-MB-231、HCC1806、HCC1937）均購自上海富衡生物有限公司，乳腺癌細(xì)胞BT549 和MDA-MB-468 由蘇州大學(xué)唐仲英醫(yī)學(xué)研究院周泉生課題組饋贈。DMEM、RPMI 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco公司，MCF-10A 細(xì)胞專用培養(yǎng)基購自普諾賽公司，PBS、0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）細(xì)胞消化液購自Bio Basic Inc 公司，TRIzol 試劑、DEPC 水均購自Invitrogen 公司，Polyplus 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO 公司，qPCR 試劑盒購自南京諾唯贊公司，CCK-8 試劑盒購自Biolite Biotech 公司，ECL 顯色試劑盒購自優(yōu)寧維公司，二甲基亞砜購自Sigma 公司，Transwell 小室購自Millipore 公司，F(xiàn)NDC10-siRNA由吉瑪基因公司合成，qPCR引物由蘇州鴻迅生物公司合成，抗E-cadherin、N-cadherin、vimentin、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-STAT3、STAT3、β-actin 單抗（一抗）和HRP 標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔二抗均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析FNDC10在乳腺癌組織中表達(dá)

在GEPIA 網(wǎng)站中查找基因FNDC10/C1orf233，在Expression DIY 欄中導(dǎo)入乳腺癌，下載FNDC10在乳腺癌中的mRNA數(shù)據(jù)，用Notepad軟件打開數(shù)據(jù)文件，將FNDC10在正常組織和乳腺癌組織中的mRNA數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel軟件，用550減去Cy值，計算FNDC10在正常組織和乳腺癌組織中的平均表達(dá)值，采用Graphpad軟件作圖并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺細(xì)胞MCF-10A使用MCF-10A專用培養(yǎng)基，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、HCC1806 和HCC1937均使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，人乳腺癌細(xì)胞BT549 和MDA-MB-468 使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA

取對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞，消化、計數(shù)，以1.5×105個/孔接種于6 孔板，生長過夜。細(xì)胞分為FNDC10 siRNA 組 和Ctrl siRNA 組，將FNDC10 siRNA 或Ctrl siRNA 與INTERFERin 依次加入opti-MEM中混勻，靜置10 min后轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，48 h后收取細(xì)胞，qPCR鑒定干擾效率。

1.5 細(xì)胞RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄

收集待檢測細(xì)胞，取5×105個細(xì)胞用500 μL 的TRIzol裂解，加入100 μL氯仿充分混勻后12 000 rpm離心10 min，吸取上層清液，加入等體積異丙醇混勻，12 000 rpm 離心10 min，倒掉上層清液，以750 μL DEPC 水配制的95%乙醇洗滌沉淀，10 000 rpm 離心8 min，倒掉上層清液，晾干沉淀，加入20 μL的DEPC水溶解沉淀，測總RNA 濃度。吸取2 μg 總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.6 qPCR檢測乳腺癌細(xì)胞中FNDC10 mRNA表達(dá)

以cDNA為模板，通過qPCR檢測細(xì)胞內(nèi)FNDC10的表達(dá)水平，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共50個循環(huán)。以0.5ΔΔCt計算FNDC10 的表達(dá)水平。qPCR 引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.7 CCK-8法檢測干擾FNDC10表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染FNDC10 siRNA 48 h后，細(xì)胞消化、計數(shù)，稀釋至1×104個/mL，以200 μL/孔接種在96孔板中，每組設(shè)置6 個復(fù)孔，以200 μL 完全培養(yǎng)基作為空白對照。分別在24、48 和72 h 后加入CCK-8 工作液，檢測在450 nm波長下培養(yǎng)孔的光密度（D）值，繪制生長曲線。

1.8 平板克隆實驗檢測干擾FNDC10表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞集落形成能力的影響

乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染FNDC10 siRNA 或?qū)φ誷iRNA 48 h 后，以2×103個細(xì)胞/孔接種在6 孔板內(nèi)，細(xì)胞在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 周，吸棄上清，PBS 洗滌2次，用瑞姬氏染液對細(xì)胞染色，風(fēng)干后顯微鏡下拍照，統(tǒng)計50個細(xì)胞以上的集落數(shù)。每組實驗重復(fù)3次。

1.9 Transwell實驗檢測干擾FNDC10表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染FNDC10 siRNA或?qū)φ誷iRNA 48 h后消化離心，用無血清培養(yǎng)基稀釋至2.5×105個/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室內(nèi)，小室外孔加入600 μL完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。吸棄小室內(nèi)培養(yǎng)基，用棉棒輕輕擦拭掉小室內(nèi)細(xì)胞，PBS洗滌2遍，用瑞氏-吉姆薩染液進(jìn)行染色，風(fēng)干后在顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞并拍照，統(tǒng)計遷移細(xì)胞數(shù)。

將Transwell 小室加入稀釋過的人工基膜（matrigel）預(yù)處理15 min 后進(jìn)行侵襲實驗，后續(xù)操作方法同遷移實驗。每組實驗重復(fù)3次。

1.10 WB法檢測干擾FNDC10表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染FNDC10 siRNA 或?qū)φ誷iRNA 48 h后消化計數(shù)，取1×106個細(xì)胞，PBS洗滌2遍，配制SDS蛋白裂解液（以1 mL計）：ddH2O 770 μL、5×SDS樣品緩沖液200 μL、蛋白酶抑制劑10 μL、1 mol/L DTT 10 μL、100 mmol/L PMSF 10 μL。向每個樣品中加入100 μL裂解液并迅速吹打混勻。每個樣品超聲60 s，95 ℃金屬浴加熱5 min。進(jìn)行10% SDS-PAGE后將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。用稀釋過的一抗4 ℃處理過夜，次日吸棄一抗，TBST 洗滌3 次，室溫下加入對應(yīng)的HRP 標(biāo)記的二抗并放置1 h，吸棄二抗并用TBST 洗滌3 次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液后在Tanon化學(xué)發(fā)光儀中拍照，并用ImageJ進(jìn)行灰度分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗獨立重復(fù)3次，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，對WB分析中電泳圖片的灰度掃描數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行整理，并用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。以P<0.05 或P<0.01 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FNDC10在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)

為了研究乳腺癌中FNDC10 的表達(dá)情況，在TCGA 數(shù)據(jù)庫中檢索了乳腺癌組織中FNDC10 mRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)，通過分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC10 在乳腺癌組織（n=1 085）中的表達(dá)比正常組織（n=291）高4.8倍（圖1A，P<0.01），提示FNDC10在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

qPCR 檢測FNDC10 在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖1B）顯示，F(xiàn)NDC10 在乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231 和BT549 中呈高表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。因此，后續(xù)實驗選用MCF-7 和MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染和機(jī)制研究。

2.2 敲低FNDC10表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖

使用FNDC10 siRNA 轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后檢測干擾效率，結(jié)果（圖2A、B）顯示，與Ctrl siRNA相比，2條siRNA均能有效抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中FNDC10 的表達(dá)（P<0.01）。CCK-8 實驗檢測敲低FNDC10 后對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果（圖2C、D）顯示，敲 低MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞中FNDC10 表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力明顯降低（P<0.05 或P<0.01）。通過平板克隆實驗檢測乳腺癌細(xì)胞的集落形成能力，結(jié)果顯示，與對照組相比，敲低MCF-7 細(xì)胞（圖2E、F，P<0.01）和MDA-MB-231（圖2G、H，P<0.01）中FNDC10 表達(dá)后細(xì)胞集落形成能力明顯減弱。以上結(jié)果顯示，敲低FNDC10表達(dá)能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。

2.3 敲低FNDC10表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲

Transwell 遷移實驗結(jié)果（圖3A～D）顯示，敲低FNDC10表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的遷移能力均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。侵襲實驗結(jié)果（圖3E～H）表明，敲低MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中FNDC10表達(dá)后，細(xì)胞侵襲能力明顯降低（P<0.05或P<0.01）。以上結(jié)果表明，敲低FNDC10表達(dá)能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

2.4 敲低FNDC10對乳腺癌細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

敲低乳腺癌細(xì)胞中FNDC10表達(dá)后，通過WB檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況，結(jié)果（圖4）顯示，與對照組相比，敲低FNDC10 后乳腺癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)明顯升高（P<0.01），而Ncadherin 和vimentin 的表達(dá)降低。該結(jié)果說明敲低FNDC10 抑制乳腺癌的EMT。

2.5 敲低FNDC10表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞STAT3信號活化

通過WB 檢測乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路變化，結(jié)果（圖5）表明，敲低乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 中FNDC10 表達(dá)后，STAT3 的磷酸化明顯降低（P<0.05 或P<0.01），而對MAPK 和NF-κB細(xì)胞通路沒有影響。以上結(jié)果表明，F(xiàn)NDC10 促進(jìn)STAT3信號通路的活化。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年增高[2]。由于缺乏早期診斷技術(shù)，絕大多數(shù)乳腺癌患者在確診時已經(jīng)處于中晚期。中晚期乳腺癌患者極易發(fā)生癌細(xì)胞擴(kuò)散，且不宜進(jìn)行手術(shù)切除，因此，療效不佳。靶向治療一直是包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥的有效治療策略，但是由于癌細(xì)胞內(nèi)基因突變率高，多數(shù)靶點特異性不足，導(dǎo)致目前已有的靶向治療獲益率較低[13-14]。因此，需要尋找新的更具有特異性的靶點來提高乳腺癌早期診斷率和治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC10 在乳腺癌中高表達(dá)，并能促進(jìn)乳腺癌增殖和侵襲。因此，F(xiàn)NDC10可能成為乳腺癌治療的新的潛在靶點。

FNDC蛋白家族中多個成員已被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。FNDC1在胃癌中高表達(dá)且與胃癌預(yù)后不良相關(guān)，并通過Wnt/β-catenin 通路促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移[15-16]。FNDC3b高表達(dá)預(yù)示宮頸癌和肝癌預(yù)后不良，前者通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)宮頸癌轉(zhuǎn)移[17-18]。FNDC4通過PI3K/Akt信號通路促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。然而，尚少見FNDC10 在腫瘤中作用的報道。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC10能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲，提示FNDC10在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

STAT3信號通路參與多種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)程[20-22]。STAT3作為經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄因子，可通過不同基因促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，包括c-MYC，c-Jun，PLK-1，Pim1/2，Bcl2，VEGF，bFGF和CTEN等[23]。因此，STAT3也成為抗癌研究的熱門靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低FNDC10表達(dá)能夠有效抑制STAT3的磷酸化和STAT3信號通路的激活，從而抑制了乳腺癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低乳腺癌細(xì)胞中FNDC10促進(jìn)了EMT標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)。E-cadherin通過抑制EMT而減少腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[24]。因此推測，F(xiàn)NDC10通過增強(qiáng)STAT3信號通路活化而促進(jìn)乳腺癌惡性進(jìn)展，但是STAT3上下游調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FNDC10在乳腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，敲低FNDC10 可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，并初步揭示FNDC10 通過STAT3 信號通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的新機(jī)制，為乳腺癌臨床治療和診斷提供了新方法、新策略。