朱曄 綜述；佟仲生，趙偉鵬 審閱（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤內(nèi)科 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 天津市腫瘤防治重點實驗室 天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津 300060）

腫瘤相關(guān)抗原（TAA）是傾向于在腫瘤細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)或異常表達(dá)的自身抗原，在部分正常細(xì)胞中也可表達(dá)。與TAA 不同，腫瘤特異性抗原（TSA）由致癌病毒表達(dá)的抗原和癌癥突變編碼的新抗原組成，在正常組織中不存在。而腫瘤新抗原（neoantigen）是體細(xì)胞DNA突變產(chǎn)生的TSA，他們不僅具有很強的腫瘤特異性，而且具有很高的免疫原性，因此高親和力的T細(xì)胞才可能存在并被這些抗原強烈激活[1]。新抗原通常對主要組織相容性復(fù)合物（MHC）分子具有高親和力，大多數(shù)新抗原是個別患者的腫瘤所特有的，并且不受免疫耐受機制的影響[1-3]。腫瘤免疫治療是近年來癌癥領(lǐng)域研究的熱點，抗原提呈細(xì)胞提呈腫瘤細(xì)胞表面特異性新抗原表位，這些新抗原進(jìn)一步被T 細(xì)胞識別，激活機體免疫系統(tǒng)，從而達(dá)到消滅腫瘤的效果。三陰性乳腺癌（TNBC）約占新診斷乳腺癌的10%～20%，由于其生物學(xué)侵襲性以及在病理和分子水平上的異質(zhì)性，使其更容易擴散和復(fù)發(fā)，患者存活率往往低于其他病理類型的乳腺癌[4]。患有TNBC 的患者不能從內(nèi)分泌治療或靶向治療中受益，化療是目前治療TNBC的主要手段，而免疫治療與腫瘤新抗原研究為TNBC治療開辟了新思路[4-5]。

1 TNBC免疫治療現(xiàn)狀及前景

近期的幾項研究為利用免疫檢查點抑制劑聯(lián)合化療治療TNBC 提供了依據(jù)。IMpassion130（NCT02425891）[6]是一項隨機、安慰劑對照、雙盲的3 期臨床試驗，研究表明，與接受白蛋白結(jié)合性紫杉醇加安慰劑的患者相比，接受抗PD-L1 阿特珠單抗和白蛋白結(jié)合性紫杉醇的TNBC 患者觀察到無進(jìn)展生存期（PFS）顯著改善，中位總生存期（OS）值顯著提高[PD-L1+腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞陽性（IC+）人群中，阿特珠單抗組和安慰劑組PFS 分別為7.5 個月和5.3 個月，中位OS 分別為25 個月和18 個月]。

IMpassion031（NCT03197935）研究[7]證實，在意向治療人群（ITT）中，同安慰劑聯(lián)合化療相比，阿特珠單抗聯(lián)合化療組患者的病理完全緩解率（pCR）提升16.5%，差異具有臨床和統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0044）。另一項來自Ⅲ期KEYNOTE-355 的試驗[8]研究了抗PD-1藥物帕博利珠單抗聯(lián)合化療對比安慰劑聯(lián)合化療用于初治的局部復(fù)發(fā)且不可手術(shù)或轉(zhuǎn)移性TNBC（mTNBC），數(shù)據(jù)顯示，帕博利珠聯(lián)合化療組治療mTNBC（患者PD-L1 的CPS 評分≥10）可顯著改善患者PFS,帕博利珠單抗-化療和安慰劑-化療組的中位PFS分別為9.7個月和5.6個月，具統(tǒng)計學(xué)和臨床意義（P=0.0012）。以上研究說明，免疫療法對TNBC治療有效且值得進(jìn)一步的試驗和應(yīng)用。

2 TNBC基因突變與新抗原

TNBC表現(xiàn)出多樣的突變模式，SHAH等[9]對149例原發(fā)TNBC冷凍標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與其他突變相比，TP53、PIK3CA和PTEN突變尤為多見。在TNBC中，TP53和PIK3CA的突變頻率分別為82%和10%，而且TP53 突變的類型主要是無義突變和移碼突變[10-11]。同樣，另一項針對104 例TNBC 樣本的測序研究結(jié)果[12]顯示，TP53的突變頻率為82.7%。

BARECHE 等[13]對公開數(shù)據(jù)庫METABRIC（Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium）和TCGA（The Cancer Genome Atlas）分析發(fā)現(xiàn)，在485 例TNBC 腫瘤樣本中獲得了447 例測序數(shù)據(jù)，從而鑒定出了2 273 個體細(xì)胞突變，包括1 994 個點突變和279 個小插入/缺失突變（INDel）。這項研究表明，在全球TNBC 隊列中，TP53、MUC16和PIK3CA 是最常見的外顯子區(qū)域突變基因。2019年ZHANG 等[14]使用一個由33 個乳腺癌相關(guān)基因組成的集合對中國廣東省人民醫(yī)院乳腺癌患者的基因組進(jìn)行靶向測序，并進(jìn)一步將結(jié)果與TCGA中453名乳腺癌患者的結(jié)果進(jìn)行了比較。在TNBC組中，80%的樣本含有TP53突變，突變頻率最高的基因是TP53（45%），其次是PIK3CA（44%）、GAT A3（18%）和MAP3K1（10%），兩組的TP53突變頻率無明顯差異，但廣東省的數(shù)據(jù)顯示TP53突變類型主要是錯義突變和無義突變，與國外的研究結(jié)果略有差異。

在預(yù)后方面，POP等[15]利用NGS技術(shù)對TNBC患者隊列中46 個在癌癥中起作用的基因進(jìn)行測序，生存曲線分析顯示，AKT1、TP53、KDR、KIT、BRCA1、BRCA2突變與不良預(yù)后相關(guān)。北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院研究者[16]檢測了187 名MBC（轉(zhuǎn)移性乳腺癌）患者血液樣本中循環(huán)游離DNA 的TP53 突變譜。在TNBC 組中，TP53 突變患者的中位DFS（無病生存期）顯著短于TP53 野生型患者（P=0.023），說明TP53 突變患者的預(yù)后明顯較TP53 野生型患者更差。由于TP53 在大多數(shù)TNBC病例中發(fā)生突變，表明它是抗腫瘤治療的一個有吸引力的候選靶點。已經(jīng)研發(fā)了幾種針對TP53 突變的化合物，其中一些化合物，特別是PRIMA-1、4-246 PK11007 和COTI-2，已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌臨床前模型中顯示出抗癌活性[17-18]。

體細(xì)胞非同義突變產(chǎn)生的新抗原是腫瘤特異性T細(xì)胞的關(guān)鍵靶點，但只有少數(shù)具有免疫原性的突變是由MHC分子在癌細(xì)胞上呈現(xiàn)的。TMB（腫瘤突變負(fù)荷）一般指特定基因組區(qū)域內(nèi)每兆堿基對（Mb）體細(xì)胞非同義突變的個數(shù)，理論上來說，具有高TMB水平的腫瘤具有高的新抗原水平，TMB 可以間接反映腫瘤產(chǎn)生新抗原的能力和程度[19]。NARANG 等[20]的工作在乳腺癌中驗證了這一點，研究顯示，TMB在乳腺癌各亞型之間有很大的差異?？傮w而言，TNBC患者樣本中非同義突變負(fù)荷的中位數(shù)最高（中位數(shù)=63）。作者把與患者特異性HLA Ⅰ類分子等位基因結(jié)合親和力≤500 nmol/L的表位稱為潛在結(jié)合新表位（potential binding neoepitopes），在三種乳腺癌亞型中，neoepitopes的數(shù)量以TNBC組最高（中位數(shù)=26）。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，在所有乳腺癌樣本包括TNBC中，Neoepitopes 與TMB 高度相關(guān)（R2=0.84；P<0.001），驗證了上述觀點。

3 新抗原與免疫治療預(yù)測指標(biāo)

目前，針對TNBC已經(jīng)開發(fā)和試驗了多種免疫療法，包括使用免疫檢查點抑制劑、誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）、過繼細(xì)胞免疫療法以及通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以增強CTL 的免疫活性[4]。越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞對新抗原的識別是實現(xiàn)各種免疫療法的關(guān)鍵，如果能夠直接找出腫瘤細(xì)胞上MHC分子呈遞的新抗原以及對新抗原產(chǎn)生反應(yīng)的T細(xì)胞，就可以利用新抗原作為靶點進(jìn)行精準(zhǔn)治療，但是現(xiàn)在還沒有這種技術(shù)。TNBC除了高度的侵襲性，其不良預(yù)后還在于缺乏治療反應(yīng)的預(yù)測生物標(biāo)志物[21]。作為新抗原形成的指標(biāo)，一些臨床研究[22]已經(jīng)檢驗了TMB與腫瘤免疫治療的相關(guān)性。在一項對非小細(xì)胞肺癌的免疫治療研究[23]和另外一項對晚期癌癥患者的免疫治療研究[24]中發(fā)現(xiàn)，較高的體細(xì)胞TMB 與較好的生存率相關(guān)。RIZVI 等[25]對使用pembrolizumab 治療的非小細(xì)胞肺癌的研究也驗證了上述結(jié)論。同樣，在轉(zhuǎn)移性TNBC 中也有類似的發(fā)現(xiàn)，接受抗PD-1/PD-L1 治療的患者中，高TMB 和PTEN 改變分別與較長和較短的生存期相關(guān)[26]，但是這些觀察需要在更大的數(shù)據(jù)集中進(jìn)行驗證。KESKIN等[27]在一項Ⅰ/Ⅰb期試驗中發(fā)現(xiàn)，接受新抗原疫苗的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者可以產(chǎn)生新抗原特異性CD4+和CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)，這說明對于像膠質(zhì)母細(xì)胞瘤這種突變負(fù)擔(dān)較低的腫瘤，新抗原疫苗也是一種可行的療法。然而，綜合多種檢測指標(biāo)才能更準(zhǔn)確地預(yù)測患者對免疫治療的反應(yīng)。在一項研究新輔助化療聯(lián)合帕博利珠單抗治療高危、早期TNBC的Ⅰb期試驗[28]中發(fā)現(xiàn)，腫瘤PD-L1表達(dá)和腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤水平與病理完全緩解呈正相關(guān)。新抗原是癌細(xì)胞通過非同義突變產(chǎn)生的一種異常蛋白質(zhì)[29]，或許這些研究間接證明了新抗原作為腫瘤免疫治療預(yù)測指標(biāo)的可行性。

4 T細(xì)胞對腫瘤新抗原的識別

腫瘤新抗原領(lǐng)域的快速發(fā)展得益于測序技術(shù)和生物信息學(xué)的進(jìn)步，新的技術(shù)使預(yù)測和新抗原鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性不斷提高。2012 年[30]和2013 年[31]的兩項研究利用全外顯子組測序（WES）技術(shù)分別在小鼠和人類黑色素瘤中證實了腫瘤新抗原特異性T細(xì)胞的存在并評估了這些T 細(xì)胞的反應(yīng)性。隨后這種T 細(xì)胞的反應(yīng)性在消化道腫瘤中也得到了證實[32-33]。越來越多的研究證明T細(xì)胞對腫瘤新抗原的識別是實現(xiàn)免疫治療的關(guān)鍵。但是，在大量預(yù)測到的新抗原中，僅有少數(shù)能被患者自體T細(xì)胞識別[34]。

COHEN等[35]第一次成功地在免疫治療前從患者外周血中分離出突變反應(yīng)性T細(xì)胞，他們利用WES、RNA 測序等技術(shù)在5 名轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中鑒定出9 個突變表位并分離出與其中8 個表位可以產(chǎn)生反應(yīng)的T細(xì)胞。不久之后的一項研究[34]證明，健康供者外周血中的T 細(xì)胞也可以有效識別患者來源的新抗原表位，甚至是在患者體內(nèi)被自身腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞忽略的表位。這些成果為設(shè)計個性化免疫療法奠定了基礎(chǔ)。

在突變率較低的乳腺癌方面，ZACHARAKIS等[36]在一例化療耐藥的激素陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了新抗原特異性T 細(xì)胞并聯(lián)合IL-2 和免疫檢查點抑制劑介導(dǎo)了腫瘤的完全持久消退。NARANG等[20]開發(fā)了一種快速的生物信息學(xué)篩選策略“EpitopeHunter”，通過對體細(xì)胞突變的分析來優(yōu)先識別臨床相關(guān)新抗原表位，并將其應(yīng)用于來自TCGA的870例乳腺癌樣本包括TNBC。EpitopeHunter表位篩選流程大致分為以下步驟：（1）收集并篩選腫瘤組和正常組外顯子測序數(shù)據(jù)的差異體細(xì)胞突變；（2）分析體細(xì)胞突變并生成新表位候選列表。這一步驟將為每個非同義的腫瘤特異性突變產(chǎn)生總共38個潛在的新表位，長度從8到11個氨基酸不等；（3）HLA分型：HLA 分型可以使用任何一個可用于MHC Ⅰ類的HLA 分類程序來執(zhí)行，這里作者使用Polysolver[37]；（4）基于IEDB（The Immune Epitope Database）[38]分篩選候選表位。使用IEDB 結(jié)合親和力預(yù)測算法預(yù)測哪些新表位與患者特定的HLA等位基因結(jié)合的可能性較高，并根據(jù)RNAseq表達(dá)篩選高親和力結(jié)合的等位基因。在另外一項研究中，ZHANG 等[39]對來自TNBC 患者的異種移植物WHIM30 進(jìn)行外顯子測序得到一個體細(xì)胞突變列表，然后通過RNA 測序進(jìn)行表達(dá)分析，接下來通過HLA Ⅰ類肽結(jié)合算法NetMHC v3.2[40-41]進(jìn)行評估，以預(yù)測與患者HLA 等位基因高親和力結(jié)合的新抗原，最后進(jìn)行體外和體內(nèi)免疫分析驗證新抗原的免疫原性。研究結(jié)果表明，對乳腺癌新抗原富集的人類CD8+T細(xì)胞能夠保護(hù)小鼠免受來自患者自身的異種移植物的腫瘤攻擊，他們還發(fā)現(xiàn)來自TNBC 患者的異種移植WHIM30 的體細(xì)胞突變遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于來自Luminal 亞型乳腺癌患者的WHIM35和WHIM37。

總結(jié)下來，對新抗原的鑒定大致可以分為三步，首先對患者正常組織和腫瘤組織進(jìn)行DNA 和RNA測序分析，找出非同義體細(xì)胞突變和異常蛋白；其次利用計算機模型分析預(yù)測抗原的免疫原性并確定其與MHC分子的結(jié)合能力，然后合成與預(yù)測表位相對應(yīng)的多肽；最后設(shè)計免疫學(xué)實驗對預(yù)測的新抗原進(jìn)行驗證[22,42-43]，見圖1。

5 新抗原疫苗進(jìn)展

新抗原疫苗可以引起患者體內(nèi)新抗原特異性T細(xì)胞的反應(yīng)，增強免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用。FDA 于2010 年批準(zhǔn)了首個治療性癌癥疫苗Sipuleucel-T用于治療前列腺癌[44]。2017年的兩項針對黑色素瘤開發(fā)的新抗原疫苗均取得了良好的療效[45-46]。2020年OTT等[47]的另一項對晚期黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或膀胱癌的臨床試驗證明了一種基于新抗原的個性化疫苗聯(lián)合免疫治療可以刺激機體產(chǎn)生新抗原特異性CD4+和CD8+T 細(xì)胞，而且這些細(xì)胞具有細(xì)胞毒性并能夠向腫瘤轉(zhuǎn)移。KARASAKI等[48]也證明了肺癌中新抗原疫苗的有效性。以上的這些研究證明了個人新抗原疫苗是安全、可行的，并且能夠在臨床環(huán)境中激發(fā)強烈的T細(xì)胞反應(yīng)。此外，在乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和胃腸道腫瘤中均有新抗原疫苗的研究[27,49-50]。在TNBC 方面，也有多種在研的新抗原疫苗，見表1。

表1 針對TNBC的新抗原疫苗臨床試驗（Home-ClinicalTrials.gov）

NCT02427581[51]是旨在評估個性化合成長肽乳腺癌疫苗在新輔助化療后持續(xù)TNBC 患者中的安全性和免疫原性的Ⅰ期臨床試驗。研究人員將在第1天、第4 天、第8 天、第15 天、第22 天、第50 天和第78天對患者注射個性化合成長肽疫苗。

NCT03199040[52]是一項單獨使用新抗原DNA疫苗與新抗原DNA疫苗聯(lián)合durvalumab治療TNBC的隨機Ⅰ期臨床研究?；颊弑浑S機分為兩組，第一組患者在第1 天、第29±7 天、第57±7 天、第85±7 天、第113±7天和第141±7天接種新抗原DNA疫苗，每次間隔至少21 d。第二組患者在此基礎(chǔ)上，將在第85 天前評估新抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，如果出現(xiàn)新抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，Durvalumab將在第85天開始注射，在60 min的療程中以1 500 mg的劑量每四周給予一次。如果沒有新抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，這些患者將被替換，但是仍有可能繼續(xù)接受新抗原DNA 疫苗治療。

NCT04105582[53]是一項對已經(jīng)完成常規(guī)治療（化療和/或手術(shù)）的患者接種含有合成肽的樹突狀細(xì)胞疫苗的試驗，利用含有腫瘤自身突變的合成肽對TNBC患者進(jìn)行接種，這些突變將由自體樹突狀細(xì)胞提呈，以評估這種類型個體化疫苗的免疫原性（最后一次接種后6個月，通過ELISPOT或ELISA檢測T細(xì)胞對腫瘤特異性新抗原的反應(yīng)）和安全性（接種疫苗一年后，用CTCAEv4.0 評估與治療相關(guān)的不良事件的患者人數(shù)）。

NCT02316457[54]是一項針對TNBC 中RNA 疫苗的研究。IV AC_W_bre1_uID（也稱為IVAC Warehouse）是一種個體化的癌癥疫苗，IVAC WAREHOUSE是現(xiàn)成的針對共享的腫瘤相關(guān)抗原的RNA 疫 苗。IVAC_M_uID（也被稱為IVAC MUTANOME），它是通過NGS 技術(shù)來鑒定腫瘤特異性突變并按需制造出的RNA疫苗，用于單個患者，以針對來自突變表位的多個新抗原。患者在接種RNA疫苗后，RNA被抗原提呈細(xì)胞呈遞給T細(xì)胞，蛋白質(zhì)由MHC Ⅰ/Ⅱ類分子提呈，從而激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和針對腫瘤特異性抗原的記憶T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

NCT03606967[55]旨在評估轉(zhuǎn)移性TNBC 患者對白蛋白紫杉醇+durvaluaxel（MEDI4736）+tremelimumab+新抗原疫苗與白蛋白紫杉醇+durvaluaxel（MEDI4736）+tremelimumab 的不同臨床反應(yīng)和安全性。將患者隨機分為2組，第一組患者在第1、4、8、15、22、50 和78 天接受個體化合成長肽疫苗治療；在第1～4 周期（28 d 為1 周期）的第1 天接受tremelimumab 治療超過60 min；在第1天接受durvalumab治療超過60 min；在第1、8和15天接受白蛋白紫杉醇治療超過30 min。第二組患者患者除了不接受個體化合成長肽疫苗治療，其他治療與第一組相同。治療結(jié)束后，每3個月對患者進(jìn)行一年的隨訪，之后每年進(jìn)行一次。

NCT02348320[56]是一項評估新輔助化療后持續(xù)性TNBC患者接受個體化多表位DNA疫苗安全性和免疫原性的Ⅰ期臨床研究。這項研究的目標(biāo)是招募30 名患者，他們將在第1 天、第29 天+/（1～7）天和第57 天±7 天接受4 mg 個性化多表位DNA 疫苗的治療，兩次注射至少間隔21 d。

NCT04024800[57]旨在建立AE37 疫苗與pembrolizumab 聯(lián)合使用的推薦生物劑量，以增強腫瘤特異性免疫反應(yīng)，并證明對晚期TNBC 患者的療效。這項研究將分兩部分進(jìn)行，第一階段的13 名患者將接受AE37 疫苗治療1 000 μg，在每個周期（21 d為1 周期）的第1 天分兩次皮內(nèi)注射，連續(xù)5 周期；在每個周期第1 天靜脈注射200 mg pembrolizumab，連續(xù)2 年（21 d 為1 周期），以確定AE37 疫苗和pembrolizumab聯(lián)合使用的推薦劑量。第二階段將隊列擴大為16 名患者繼續(xù)使用第一階段確定的AE37的推薦劑量。

6 結(jié)語

T 細(xì)胞對新抗原的識別作為免疫治療的重要一環(huán)發(fā)揮了不可替代的作用，新抗原來源于突變，但不是所有的突變都可以產(chǎn)生新抗原。只有少數(shù)由MHC分子提呈在癌細(xì)胞表面被T 細(xì)胞識別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答的多肽才可以稱為新抗原。因此，體細(xì)胞突變是否能產(chǎn)生新抗原取決于以下的關(guān)鍵因素：體細(xì)胞突變是否在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)；突變的蛋白是否可以自然加工成合適的肽來提呈；突變肽與患者自身MHC分子的結(jié)合親和力；突變肽/MHC復(fù)合物與T細(xì)胞受體的親和力。隨著高通量檢測突變相關(guān)表位的方法以及新表位預(yù)測的生物信息學(xué)工具的出現(xiàn)，目前對于新抗原的鑒定識別已經(jīng)在多個癌種中實現(xiàn)，現(xiàn)在還需要更加精準(zhǔn)的篩選策略來檢測出更多有效的新抗原表位，從而生產(chǎn)出針對個體的新抗原疫苗。近年來對新抗原疫苗的研究證明這是一種有效、有針對性的個體化治療。對于TNBC 這種沒有特異性療法的難治性癌癥，不論是DNA 疫苗、RNA 疫苗、DC疫苗還是肽疫苗，不論是單獨應(yīng)用還是聯(lián)合免疫檢查點抑制劑一起治療都已經(jīng)有了多種在研臨床試驗。但是對于腫瘤患者來說，還需要更加經(jīng)濟有效的、適用于更多人的治療方法。相信在未來，隨著對TNBC 的核心臨床困境和生物學(xué)特征進(jìn)一步深入研究，基于新抗原的治療能帶來更多驚喜。