王羽，曹佳麗，陳哲聰，高夢(mèng)源，陳文虎（杭州醫(yī)學(xué)院.藥學(xué)院；.臨床醫(yī)學(xué)院，.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，浙江 杭州 310059）

全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率和病死率長(zhǎng)期居惡性腫瘤首位。2018 年中國(guó)肺癌新發(fā)病例約82 萬(wàn)例、病死約71 萬(wàn)例[1]；其中以非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）最為常見(jiàn)，占發(fā)病總數(shù)的80%以上[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，經(jīng)手術(shù)治療后約40%NSCLC患者會(huì)因癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)而死亡，且術(shù)后并發(fā)癥會(huì)導(dǎo)致患者生存質(zhì)量下降[3]。由于NSCLC 前期的臨床癥狀并不明顯，大多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期，然而晚期患者的5 年生存率僅約15%[4]。因此，積極探討NSCLC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)于防治具有十分重要的意義。研究結(jié)果[5-7]表明，lncRNA能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生命活動(dòng)，且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。lncRNA小核仁RNA宿主基因11（small nucleolus RNA host gene 11，SNHG11）被發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)的多種癌癥中均表達(dá)異常[8-9]，但尚少見(jiàn)在NSCLC 中的報(bào)道。本研究探討lncRNA SNHG11 對(duì)NSCLCA549 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響及其是否通過(guò)靶向調(diào)控miR-193a-5p發(fā)揮作用，以期為NSCLC治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人NSCLC 細(xì)胞A549、NCI-H1299、HCC827 和人正常胚肺細(xì)胞HEL-1均購(gòu)自ATCC，均用含10%FBS、1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每1～2 d 更換1 次培養(yǎng)基。FBS、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco 公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、一抗稀釋液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光劑均購(gòu)自上海碧云天公司，小鼠抗人PCNA 單克隆抗體、兔抗人cyclin D1 多克隆抗體、兔抗人GAPDH 單克隆抗體均購(gòu)自CST 公司，SNHG11、miR-193a-5p 的引物均購(gòu)自北京擎科公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000、TRIzol 試劑均購(gòu)自Invitrogen 公司，Prime Script 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green PCR 實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒均購(gòu)自TaKaRa 公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自北京索萊寶公司，lncRNA SNHG11小干擾RNA（si-SNHG11）及其陰性對(duì)照（NC siRNA）、lncRNA SNHG11過(guò)表達(dá)載體及對(duì)照空白載體、miR-193a-5p模擬物（mimic）及陰性對(duì)照序列（NC mimic）、miR-193a-5p 抑制劑（miR-193a inhibitor）及抑制劑陰性對(duì)照序列（NC inhibitor）均購(gòu)自上海吉瑪公司，雙熒素酶報(bào)告基因系統(tǒng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁生物公司。

1.2 qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中SNHG11 和miR-193a-5p的表達(dá)水平

使用TRIzol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA，并使用Prime Script RT 試劑盒將RNA 逆向轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR 采用TB Green PCR 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，U6 作為miR-193a-5p的內(nèi)參，β-actin作為lncRNA SNHG11的內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞調(diào)整為1×104個(gè)/mL，接種于6 孔板，當(dāng)生長(zhǎng)至60%匯合時(shí)，更換為不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將NC siRNA、si-SNHG11，NC mimic、miR-193a mimic，si-SNHG11 和NC inhibitor，si-SNHG11 和miR-193a inhibitor 分別轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞中，依次記為NC siRNA 組、si-SNHG11 組，NC mimic 組、miR-193a mimic 組，si-SNHG11+NC inhibitor 組和si-SNHG11+miR-193a inhibitor 組。qPCR 法驗(yàn)證沉默與過(guò)表達(dá)效果。

1.4 CCK-8 法檢測(cè)SNHG11 與miR-193a-5p 表達(dá)變化對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后的各 組 細(xì)胞調(diào) 整為1×104個(gè)/mL，按200μL/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度（D）值。

1.5 WB 法檢測(cè)SNHG11 與miR-193a-5p 表達(dá)變化對(duì)A549細(xì)胞中PCNA和cyclin D1表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞調(diào)整為1×106個(gè)/mL，接種于6 孔板，培養(yǎng)48 h 后胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，加入RIPA 細(xì)胞裂解液，冰上處理40 min，充分裂解后，4 ℃離心20 min，取蛋白上清液。BCA法測(cè)定蛋白含量，100 ℃煮沸5 min后冷卻至室溫，進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，再將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，分別加入抗PCNA（1∶1 000）、抗cyclin D1（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶5 000）一抗，4 ℃過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫處理2 h，TBST洗膜3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后曝光、拍照。以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SNHG11 與miR-193a-5p 表達(dá)變化對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響

人工基膜（matrigel）液化后用4 ℃的無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶8 比例稀釋?zhuān)?0 μL 加入Transwell 小室上室，自然晾干；轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞用不含血清的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整至2×105個(gè)/mL，加入100μL 細(xì)胞懸液至上室，下室加入500μL含10%FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后取出小室，棄培養(yǎng)基，棉簽擦去基質(zhì)膠和上層小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，用4%甲醛固定穿膜細(xì)胞30 min、0.4%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SNHG11 與miR-193a-5p 表達(dá)變化對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響

用記號(hào)筆在6孔板背后均勻劃4條直線，橫穿過(guò)孔，調(diào)整各組細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，棄培養(yǎng)基，用10μL 無(wú)菌移液器吸頭尖端在各孔相同位置劃線，PBS沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞，每孔加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證SNHG11與miR-193a-5p間的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，SNHG11 與miR-193a-5p 的核苷酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含SNHG11 野生型序列的重組載體（SNHG11 WT）與SNHG11 突變型載體（SNHG11 MUT）。分別將SNHG11 WT、SNHG11 MUT 與NC mimic 或miR-193a mimic共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，裂解、離心、收集上清液，檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05或P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA SNHG11 和miR-193a-5p 在NSCLC 細(xì)胞中分別呈高、低表達(dá)

qPCR 檢測(cè)結(jié)果（圖1）表明，與HEL-1 細(xì)胞相比，在NSCLC 細(xì)胞中SNHG11 呈明顯高表達(dá)（均P<0.05），其中A549細(xì)胞最為明顯；而miR-193a-5p呈明顯低表達(dá)（均P<0.05），其中A549 細(xì)胞最為明顯。選擇A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 沉默lncRNA SNHG11表達(dá)對(duì)NSCLCA549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

qPCR 檢 測(cè)結(jié)果（圖2A）顯示，si-SNHG11 組A549 細(xì)胞株中SNHG11 的表達(dá)顯著低于NC siRNA組（P<0.05），說(shuō)明轉(zhuǎn)染si-SNHG11 成功沉默了A549細(xì)胞株中SNHG11 的表達(dá)。CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果（圖2B）顯示，si-SNHG11 組A549 細(xì)胞的增殖水平顯著低于NC siRNA 組（P<0.05）；WB 法檢測(cè)結(jié)果（圖2C 和2D）顯示，si-SNHG11 組A549 細(xì)胞中PCNA、cyclin D1 蛋白的表達(dá)水平顯著低于NC siRNA 組（P<0.05）；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)（圖2E）和Transwell實(shí)驗(yàn)（圖2F）檢測(cè)結(jié)果顯示，si-SNHG11組A549細(xì)胞的遷移能力和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于NC siRNA組（P<0.05）。

2.3 miR-193a-5p 過(guò)表達(dá)對(duì)NSCLCA549 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

qPCR檢測(cè)結(jié)果（圖3A）顯示，miR-193a mimic組A549細(xì)胞中miR-193a-5p的水平顯著高于NC mimic組（P<0.01）。CCK-8法（圖3B）、WB法（圖3C）、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)（圖3D）和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)（圖3E）檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-193a mimic組A549細(xì)胞的增殖水平、PCNA和cyclin D1蛋白的表達(dá)、遷移能力與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于NC mimic組（均P<0.05）。

2.4 lncRNA SNHG11靶向負(fù)調(diào)控miR-193a-5p表達(dá)

利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Starbase 3.0在線預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4A）顯示，lncRNA SNHG11 的序列中含有與miR-193a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了兩者的靶向關(guān)系（圖4B）。qPCR 檢測(cè)結(jié)果（圖4C）顯示，si-SNHG11 組A549 細(xì)胞中miR-193a-5p的表達(dá)水平顯著高于NC siRNA組（P<0.01）。

2.5 抑制miR-193a-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了沉默SNHG11 對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

將SNHG11 的干擾siRNA 和miR-193a-5p 的inhibitor 共轉(zhuǎn)染至A549 后，CCK-8 和WB 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（圖5A、B）表明，miR-193a inhibitor 逆轉(zhuǎn)了沉默SNHG11 表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞增殖能力的降低（P<0.05），也部分逆轉(zhuǎn)了PCNA 和cyclin D1表達(dá)的降低（均P<0.05）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5C、D）表明，miR-193a inhibitor 也逆轉(zhuǎn)了干擾SNHG11表達(dá)引起的細(xì)胞遷移和侵襲能力的降低（均P<0.05）。

3 討論

肺癌分為NSCLC和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC占85%。NSCLC 的發(fā)病受多基因調(diào)控，其發(fā)病機(jī)制并不明了[10]。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲，在腫瘤中表現(xiàn)出異常的表達(dá)和調(diào)節(jié)活性，這些發(fā)現(xiàn)為指導(dǎo)疾病治療和診斷提供新策略。

作為lncRNA 最主要的功能之一，其可以充當(dāng)miRNA 海綿，與miRNA 目標(biāo)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，以抑制miRNA 活性并參與miRNA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。例如，lncRNA PCAT6 在骨肉瘤組織中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)靶向miR-139-3p 抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡[13]。lncRNA DANCR 通過(guò)調(diào)控miR-214-5p促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲，提示其在宮頸癌中是一個(gè)具有促癌作用的分子，并有可能作為診斷和治療的靶點(diǎn)[14]。lncRNA LINC00460 在NSCLC 患 者的癌組織中表達(dá)上調(diào)，且影響NSCLC 患者預(yù)后，是NSCLC 預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[15]。前期研究結(jié)果[16]證實(shí)，lncRNA SNHG17 可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-338-3p/SOX4 軸促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和遷移。SNHG11 是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-184/AGO2促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡[17]，通過(guò)調(diào)節(jié)miR339-3p/SHOX2 軸促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)展[18]。因此，SNHG11被認(rèn)為是潛在的促癌因子。本研究發(fā)現(xiàn)，SNHG11 在NSCLC 細(xì)胞中呈高表達(dá)。進(jìn)一步探討SNHG11 對(duì)NSCLC 細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，結(jié)果顯示，沉默SNHG11的表達(dá)可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲、遷移，提示SNHG11 可能具有作為NSCLC治療生物標(biāo)志物的潛力。

miR-193a-5p對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲遷移具有重要作用，如miR-193a-5p 通過(guò)下調(diào)HOXA7 抑制人卵巢癌細(xì)胞的增殖[19]，通過(guò)影響SRSF6 介導(dǎo)的OGDHL和ECM1選擇性剪接促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[20]。此外，lncRNA TUG1 可通過(guò)海綿吸附miR-193a-5p 從而提高AML細(xì)胞的活力[21]。本研究證明，miR-193a-5p在NSCLC 細(xì)胞中呈低表達(dá)，而過(guò)表達(dá)miR-193a-5p 能夠抑制A549 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到SNHG11 與miR-193a-5p 存在結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了兩者關(guān)系；沉默SNHG11 表達(dá)可上調(diào)NSCLC 細(xì)胞中miR-193a-5p的水平。而抑制miR-193a-5p 表達(dá)則能夠逆轉(zhuǎn)沉默SNHG11 表達(dá)對(duì)NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SNHG11在NSCLC細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默SNHG11可通過(guò)調(diào)節(jié)與其直接結(jié)合的miR-193a-5p發(fā)揮調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的作用。SNHG11 可能成為NSCLC 治療潛在新靶點(diǎn)。