馬勇，蘇阿德，陳志濤，俞澤元，焦作義（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科，甘肅蘭州 730000）

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、治療效果和預(yù)后極差的惡性腫瘤，其發(fā)病率現(xiàn)居中國惡性腫瘤第八位，是全球癌癥死亡的第七大原因[1]。僅2019年，美國就有56 770 例新發(fā)病例和45 750 例病死病例，患者五年生存率僅為9%[2]。目前，胰腺癌的治療手段仍以手術(shù)治療聯(lián)合化療為主，由于其早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已處于中晚期，90%患者無法進(jìn)行根治性手術(shù)切除，再加以胰腺癌迅速生長、廣泛轉(zhuǎn)移及易耐藥的特性，使現(xiàn)有治療手段的療效也十分有限，患者預(yù)后很差[3]。因此，挖掘胰腺癌特異性生物標(biāo)志物對胰腺癌患者的早期診斷、有效治療策略的制定及改善預(yù)后具有重要意義。Claudin-7（CLDN-7）是一種緊密連接蛋白，其高表達(dá)可以早期預(yù)警腫瘤的發(fā)生[4]，與腫瘤的增殖、侵襲和維持間充質(zhì)狀態(tài)有密切關(guān)系[5-6]，并且CLDN-7的高表達(dá)還可以降低腫瘤對化療藥物的敏感性[7]。因此，探究CLDN-7 表達(dá)與胰腺癌的相關(guān)性，或許可以為突破胰腺癌目前的治療困境提供新的思路。本研究主要探討CLDN-7 在胰腺癌中表達(dá)水平及預(yù)后，利用組織標(biāo)本驗(yàn)證CLDN-7在胰腺癌與癌旁組織中的表達(dá)水平并分析其臨床病理特征，通過生物信息學(xué)分析其潛在的功能。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫資料

使用Oncomine 數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org/resource/main.html）和GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析CLDN-7在胰腺癌和癌旁組織中mRNA的表達(dá)水平；從GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載基因芯片數(shù)據(jù)集GSE16515 和GSE28735分析CLDN-7 mRNA在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)水平。使用Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）分析CLDN-7蛋白在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)水平。并從Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer）中選取CLDN-7 基因的所有胰腺癌標(biāo)本進(jìn)行生存相關(guān)性分析；選取cBioPortal 數(shù)據(jù)庫（https://www.cbioportal.org/）分析CLDN-7 基因在多種癌癥中的突變情況；選取TCGA數(shù)據(jù)庫中CLDN-7基因在胰腺癌標(biāo)本中的RNA-seq 數(shù)據(jù)，進(jìn)行GO、KEGG及與其他基因的相關(guān)性分析；選取TCGA數(shù)據(jù)庫中胰腺癌患者的臨床信息進(jìn)行單因素及多因素COX 回歸分析，利用“forestplot”R 包繪制森林圖，然后根據(jù)多因素回歸分析結(jié)果使用R軟件包“rms”建立列線圖。

1.2 臨床樣本的病理資料

選取蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科2015 年至2018年手術(shù)切除的44 例胰腺癌組織及31 例胰腺癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理檢查確診為胰腺癌；（2）術(shù)前未行放療、化療、靶向治療和免疫治療；（3）臨床病例資料及手術(shù)標(biāo)本組織保存完整；（4）隨訪記錄完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）失訪患者；（2）合并其他系統(tǒng)腫瘤患者；（3）術(shù)后因并發(fā)癥死亡患者；（4）因其他原因死亡患者。石蠟包埋固定，用于病理切片免疫組織化學(xué)染色，并收集相應(yīng)的臨床及病理資料。所有患者隨訪記錄完整，術(shù)前均無放療及化療史。

1.3 GO分析和KEGG通路富集分析

從TCGA 數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站下載胰腺癌的RNA-seq 數(shù)據(jù)，其中包括正常胰腺組織4例、腫瘤組織178例，對基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理用于后續(xù)分析。利用Molecular Signature Database（MsigDB）數(shù)據(jù)庫中的c5.go.v7.2.symbols.gmt 和c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集導(dǎo)入GSEA 4.1.0 軟件中進(jìn)行CLDN-7 的GO分析和KEGG通路富集分析，以P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測CLDN-7 在胰腺癌組織中的表達(dá)

使用胰腺癌及癌旁組織的石蠟切片進(jìn)行CLDN-7免疫組織化學(xué)染色，染色方法如文獻(xiàn)[8]所述。由2名獨(dú)立的病理醫(yī)生對切片進(jìn)行盲審評分，棕黃色為陽性染色。染色強(qiáng)度評分（參考文獻(xiàn)[9]）：0 分（染色陰性），1分（弱染色），2分（中等染色），3分（強(qiáng)染色）；染色陽性面積按陽性細(xì)胞數(shù)占比評分：0分（<5%），1分（5%～25%），2分（＞25%～50%），3分（＞50%～75%），4分（>75%）。染色評分=染色強(qiáng)度×染色陽性面積。參考文獻(xiàn)[10]的標(biāo)準(zhǔn)，最終染色評分<6 分為CLDN-7低表達(dá)，評分≥6分為CLDN-7高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 26.0對病理資料及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Graphpad Prism 8 軟件繪圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，獨(dú)立樣本及配對數(shù)據(jù)分別采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)與配對t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；計(jì)數(shù)資料以率表示，并以χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析。以P<0.05 或P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織中CLDN-7 mRNA呈高表達(dá)

通過分析cBioPortal 綜合性腫瘤數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，CLDN-7基因在胰腺癌等多種癌癥中發(fā)生突變、擴(kuò)增及刪失（圖1A）。Oncomine（圖1B-D）、GEPIA（圖1E）、GEO（圖1F-G）數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，CLDN-7 mRNA水平在胰腺癌組織中顯著上調(diào)（均P<0.05）。Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果（圖1H）顯示，CLDN-7 蛋白水平在胰腺癌中高于癌旁組織。此外，使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析CLDN-7 表達(dá)水平對胰腺癌生存預(yù)后的影響，結(jié)果顯示CLDN-7 高表達(dá)患者的總體生存率（overall survival，OS）顯著低于CLDN-7 低表達(dá)患者（P=0.004 9）（圖1I），且CLDN-7高表達(dá)患者的無復(fù)發(fā)生存率（relapse free survival，RFS）顯著低于CLDN-7低表達(dá)患者（P=0.0038）（圖1J）。

2.2 CLDN-7在胰腺癌中呈高表達(dá)且標(biāo)志著更差的臨床預(yù)后

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析顯示，CLDN-7在胰腺癌組織中的染色強(qiáng)度及染色陽性面積均高于癌旁組織（圖2A），癌組織染色評分明顯高于癌旁組織（P<0.001）（圖2B）。通過免疫組織化學(xué)染色及評分結(jié)果將胰腺癌患者分為CLDN-7 高表達(dá)組（n=29）和CLDN-7低表達(dá)組（n=15），分析其臨床病理特征及預(yù)后，如表1 所示，高表達(dá)CLDN-7 的胰腺癌患者CEA水平（P=0.045）、CA199水平（P=0.024）均顯著高于低表達(dá)CLDN-7 的胰腺癌患者；病理分期越高的患者，CLDN-7 表達(dá)水平也較高（圖2C、表1）；此外，CLDN-7高表達(dá)患者的OS 顯著低于CLDN-7低表達(dá)的患者（P=0.001）（圖2D）。

表1 CLDN-7表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胰腺癌患者總體生存時(shí)間的單因素與多因素COX回歸分析

通過COX單因素回歸模型分析44例患者的臨床病理信息，結(jié)果顯示，T分期（P=0.002）、N分期（P=0.015）、M分期（P=0.000）、腫瘤大?。≒=0.016）、分化程度（P=0.030）和CLDN-7表達(dá)水平（P=0.001）是胰腺癌患者術(shù)后總體生存時(shí)間的影響因素。利用COX回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，M 分期（P=0.000）和CLDN-7表達(dá)水平（P=0.043）是影響胰腺癌術(shù)后總體生存時(shí)間的獨(dú)立因素（表2）。通過COX 單因素回歸模型分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中178 例胰腺癌患者的臨床病理信息，結(jié)果顯示，CLDN-7表達(dá)水平（P=0.043 8）、年齡（P=0.007 7）、腫瘤的分級（P=0.010 5）是胰腺癌患者總體生存時(shí)間的影響因素（圖3A）。利用COX 回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，CLDN-7表達(dá)水平（P=0.039 1）、腫瘤的分級（P=0.003 2）、放療（P=0.003 8）是影響總體生存時(shí)間的獨(dú)立因素（圖3B）?；诙嘁蛩谻OX回歸分析結(jié)果建立函數(shù)模型，繪制預(yù)測1年、3年及5年生存率的列線圖（圖3C）。

表2 44例胰腺癌患者總體生存時(shí)間的單因素與多因素回歸分析

2.4 胰腺癌中CLDN-7 的GO 分析和KEGG 通路富集分析

GO可分為生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。分析結(jié)果顯示，CLDN-7的生物過程主要涉及凋亡過程、胞質(zhì)分裂、調(diào)節(jié)膽固醇的生物合成、核酸的補(bǔ)救合成、谷氨酰胺的代謝、細(xì)胞有絲分裂等（圖4A）；CLDN-7主要包括參與DNA解螺旋酶、細(xì)胞質(zhì)膜、端粒酶全酶、內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體、剪接體等的組成（圖4B）；分子功能主要有氧化還原酶活性、?；D(zhuǎn)移酶活性、細(xì)胞與細(xì)胞間鈣黏蛋白結(jié)合、?；鵆oA結(jié)合、氧化還原反應(yīng)催化劑等（圖4C）。KEGG通路富集分析表明，CLDN-7主要涉及堿基切除修復(fù)、亨廷頓病、磷酸戊糖旁路等（圖4D）。

2.5 CLDN-7參與胰腺癌的錯配修復(fù)和糖代謝

KEGG 通路富集分析結(jié)果（圖5A、B）顯示，CLDN-7 參與胰腺癌的錯配修復(fù)和糖代謝。經(jīng)TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證相關(guān)性，胰腺癌中CLDN-7的表達(dá)與DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因POLD4、SMUG1、NTHL1及糖代謝的相關(guān)基因ALDOA、TALDO1、PGLS 的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性（P<0.01，R>0.35）（圖5C）；經(jīng)GEPIA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證相關(guān)性，胰腺癌中CLDN-7的表達(dá)與DNA 損傷修復(fù)相關(guān)基因POLD4（P=6.6×10-10，R=0.44）、SMUG1（P=2.6×10-8，R=0.4）、NTHL1（P=1.4×10-5，R=0.31）及糖代謝的相關(guān)基因ALDOA（P=1.8×10-9，R=0.43）、TALDO1（P=4.9×10-6，R=0.33）、PGLS（P=5.2×10-7，R=0.36）的表達(dá)也呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性（圖5D、E）。

3 討論

胰腺癌是最致命、最具侵襲性的惡性腫瘤之一，早期診斷困難，容易錯過手術(shù)時(shí)機(jī)，又對化療有很強(qiáng)的抵抗作用[11]，因此在胰腺癌中探索新的基因并分析其表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系以及功能對尋找胰腺癌新的治療靶標(biāo)具有重要意義。

緊密連接對于構(gòu)建上皮細(xì)胞屏障和保持上皮極性至關(guān)重要，而claudin 蛋白是緊密連接中的關(guān)鍵成分，其功能包括維持上皮細(xì)胞極性、調(diào)節(jié)細(xì)胞間離子的通過等[12]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白尤其是CLDN-7 與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CLDN-7 的表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化，從而抑制結(jié)腸腫瘤的發(fā)生[13]，CLDN-7 表達(dá)的下調(diào)與人腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)[14]，CLDN-7通過抑制Akt磷酸化來抑制人肺鱗狀細(xì)胞癌的增殖[15]；但也有研究結(jié)果表明，CLDN-7 的高表達(dá)與胃癌的增殖、侵襲和維持間充質(zhì)狀態(tài)有密切關(guān)系[5-6]，還可以降低腫瘤對化療藥物的敏感性[7]。然而，CLDN-7在胰腺癌中的作用及機(jī)制還未見報(bào)道。

本研究利用Oncomine、GEPIA 和GEO 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，CLDN-7 在胰腺癌組織中異常高表達(dá)，且CLDN-7高表達(dá)的胰腺癌患者生存結(jié)局更差；分析胰腺癌患者免疫組化染色和臨床病理特征的關(guān)系證實(shí)，CLDN-7在胰腺癌組織中高表達(dá)且與臨床預(yù)后負(fù)相關(guān)。隨后，通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫中胰腺癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)CLDN-7與胰腺癌細(xì)胞的凋亡、增殖、糖代謝、谷氨酰胺代謝、堿基切除修復(fù)等有關(guān)。細(xì)胞周期異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]，因此推測，CLDN-7可能通過細(xì)胞周期來調(diào)控胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。為保證胰腺癌細(xì)胞的增殖與生存，癌細(xì)胞必須通過增加糖代謝和調(diào)整谷氨酰胺代謝來滿足自己合成代謝所需要的能量[17]，而CLDN-7 涉及上述通路的改變，這為利用代謝的改變來改善胰腺癌的診斷和治療提供了新的分子靶標(biāo)[18]?；瘜W(xué)治療是通過有選擇性地使細(xì)胞迅速分裂從而導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA損傷繼而細(xì)胞死亡[19-20]，而堿基切除修復(fù)作為DNA 損傷修復(fù)的一種，可能會改變這一過程[21]，亦有研究[22]初步發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CLDN-7 的胰腺癌細(xì)胞株MIA-PACA-2-對吉西他濱具有很強(qiáng)的耐藥性。上述研究結(jié)果表明，CLDN-7與胰腺癌的化療耐藥有緊密聯(lián)系，為胰腺癌患者有效治療策略的設(shè)計(jì)提供了新思路。綜上所述，CLDN-7在胰腺癌中呈高表達(dá)且與臨床預(yù)后負(fù)相關(guān)，并與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展及化療耐藥有緊密聯(lián)系，有可能成為胰腺癌診斷的新型分子標(biāo)志物和治療的新靶標(biāo)。