羅雯，郭建，樊君，伍學(xué)明

(千禾味業(yè)食品股份有限公司，四川 眉山 620000)

醬油，以大豆和小麥為主要原料經(jīng)米曲霉、酵母等多種微生物混合發(fā)酵而成。醬油不僅能改善食品的風(fēng)味和色澤，同時(shí)對(duì)人類的健康有一定的促進(jìn)作用，因此成為中國(guó)、日本等亞洲國(guó)家人民飲食中最主要的調(diào)味品之一[1-2]。

米曲霉中豐富的酶系活性的高低直接影響醬油原料利用率和產(chǎn)品品質(zhì)，其蛋白酶活性是影響醬油中可溶性含氮物含量的關(guān)鍵性因素[3]。在醬油發(fā)酵的過程中，米曲霉中的蛋白酶系將原料中的蛋白質(zhì)分解為短鏈肽和氨基酸，分解后的一部分產(chǎn)物成為醬油特有的風(fēng)味組成部分，另一部分則被醬油釀造過程中豐富的微生物菌群利用，使醬油的風(fēng)味更加豐富[4]。米曲霉的蛋白酶系以中性蛋白酶為主，但是，隨著醬油發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物的產(chǎn)酸作用會(huì)導(dǎo)致醬醪中pH一定程度地下降，從而抑制中性蛋白酶活性作用，在這一過程中，使用低酸性蛋白酶活力的米曲霉會(huì)直接影響到原料的利用率[5]。同時(shí)，有報(bào)道表明，酸性蛋白酶與其他酶混合作用下，可釋放大量的游離氨基酸，提高醬油品質(zhì)[6]。醬油中氨氮的含量是決定醬油質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，而米曲霉滬釀3.042菌株，雖然生長(zhǎng)較快、酶系豐富但同時(shí)產(chǎn)孢量大[7]。有研究表明，將米曲霉滬釀3.042菌株與選育出的高酸性蛋白酶活的米曲霉菌株混合發(fā)酵，可提高原料利用率與氨基酸生成率[8]。根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，過多的孢子數(shù)不便于操作及后期清潔，因此，選擇產(chǎn)孢量少的米曲霉菌株復(fù)合發(fā)酵，使其在特定比例下發(fā)酵時(shí)兼具高中性蛋白酶活力和高酸性蛋白酶活力同時(shí)不產(chǎn)生毒素。

1 材料與方法

1.1 材料

米曲霉菌株A2、B2為As3.042誘變菌株，A2菌絲長(zhǎng)、孢子少，B2孢子多、菌絲短，均保藏于千禾味業(yè)食品股份有限公司。

培養(yǎng)基為改良后的酪蛋白培養(yǎng)基，試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 制曲

將小麥粉、豆粕、水按比例混合，在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻至40 ℃ 以下，以0.2%的接種量在物料中接入米曲霉混合菌株，控制溫度為30 ℃、濕度為95%培養(yǎng)40～60 h，制得成曲。

1.2.2 菌種復(fù)合

將菌株A2和B2種曲按照重量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5混合拌料，以1.2.1的方法進(jìn)行制曲。

1.2.3 醬油發(fā)酵

按照1∶1.8的比例在成曲中加入鹽濃度為22%的鹽水，將拌好鹽水的成曲打入發(fā)酵池，發(fā)酵180 d，過濾醬醪，對(duì)濾液進(jìn)行下一步分析。

1.2.4 檢測(cè)

1.2.4.1 蛋白酶活力檢測(cè)

取研磨后的成曲5 g，加入100 mL蒸餾水，在40 ℃條件下浸提1 h，每10 min攪拌1次，過濾。粗酶液蛋白酶活力檢測(cè)方法參照GB/T 23527-2009[9]，中性蛋白酶活力使用pH 7.2的磷酸鈉鹽緩沖液，酸性蛋白酶活力使用pH 3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖液。

1.2.4.2 谷氨酰胺酶活力檢測(cè)

利用SBA-40C型分析儀檢測(cè)成曲及醬油中谷氨酸含量。高谷氨酸含量的成曲視為高谷氨酰胺酶活力。

成曲預(yù)處理：取研磨后的成曲1 g，加入4 mL蒸餾水，在50 ℃條件下浸提30 min，加入8 mL三氯乙酸，繼續(xù)反應(yīng)10 min，過濾，濾液待檢測(cè)。

1.2.4.3 氨基酸態(tài)氮及醬油總酸

氨基酸態(tài)氮和總酸的測(cè)定方法參照GB/T 18186-2000[10]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為3組數(shù)據(jù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始菌株相關(guān)酶活檢測(cè)

選取現(xiàn)有的3株原始菌株4#(米曲霉滬釀3.042菌株)、A2、B2按照1.2.1的方法制曲，分別測(cè)定其成曲的中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力及其谷氨酸含量，并統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 米曲霉菌株相關(guān)酶活力Table 1 The related enzyme activities of different Aspergillus oryzae strains

4#菌株為米曲霉滬釀3.042菌株，此菌種生長(zhǎng)較快、酶系豐富同時(shí)產(chǎn)孢量大。有研究表明，30 ℃條件下，成曲中孢子數(shù)與蛋白酶活力成正比[11]，但是就生產(chǎn)而言，孢子數(shù)過多可能影響工人操作，同時(shí)也不便于后期清潔。由表1可知，菌株A2、B2單獨(dú)發(fā)酵時(shí)，其成曲中性蛋白酶活均低于4#菌株，但酸性蛋白酶活力差距較小，且孢子數(shù)遠(yuǎn)低于4#菌株所產(chǎn)孢子數(shù)，因此，選擇A2、B2混合發(fā)酵，在適宜比例下，有望得到發(fā)酵性能穩(wěn)定、產(chǎn)孢量少且具有高酶活的復(fù)合米曲霉系。

2.2 A2、B2復(fù)配發(fā)酵小生產(chǎn)試驗(yàn)

將A2、B2分別以1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5這5個(gè)比例進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵制曲，并測(cè)定其成曲相關(guān)酶活，測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 不同比例A2、B2復(fù)配發(fā)酵制曲酶活檢測(cè)Fig.1 Detection of enzyme activity of koji by complex fermentation of A2 and B2 with different ratios

根據(jù)小試結(jié)果，A2、B2以1∶9的比例發(fā)酵制曲時(shí)，其中性蛋白酶活力最大，酸性蛋白酶活力僅次于C組(A2∶B2為3∶7)。

蛋白酶系是醬油釀造過程中的關(guān)鍵酶系之一，可提高原料利用率，降低生產(chǎn)成本，同時(shí)提高醬油品質(zhì)。米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶系主要以中性蛋白酶為主。中性蛋白酶可將蛋白質(zhì)分解為多肽及少量的游離氨基酸，而酸性蛋白酶則是將多肽分解為更多的游離氨基酸，從而使產(chǎn)品中含有更加豐富的氨基酸態(tài)氮[12-13]。谷氨酰胺酶可將原料中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，提高醬油的鮮味[14-15]。由圖1可知，當(dāng)A2、B2以1∶9的比例發(fā)酵制曲時(shí)，其中性蛋白酶活力遠(yuǎn)高于其他比例米曲霉復(fù)合發(fā)酵，成曲中谷氨酸含量與其他組差距不明顯，而酸性蛋白酶活力遠(yuǎn)高于單獨(dú)發(fā)酵時(shí)成曲酶活。

根據(jù)小試結(jié)果，A2、B2單獨(dú)發(fā)酵時(shí)雖然酶活低于4#菌株，但是將其按照1∶9比例混合發(fā)酵制曲時(shí)，其中性酶活高達(dá)2220.41 U/g，酸性蛋白酶活為360.49 U/g，均遠(yuǎn)高于其單獨(dú)發(fā)酵時(shí)相關(guān)酶活力，同時(shí)，將A2、B2混合發(fā)酵后，成曲中的孢子數(shù)遠(yuǎn)低于4#菌株，且中性蛋白酶活力與4#相當(dāng)，酸性蛋白酶活力遠(yuǎn)高于4#菌株發(fā)酵成曲，且混合發(fā)酵成曲中未檢測(cè)到黃曲霉毒素B1(AFB1)。

2.3 A2、B2復(fù)配發(fā)酵大生產(chǎn)試驗(yàn)

由圖1可知，將A2與B2按照1∶9的比例復(fù)配發(fā)酵后，中性蛋白酶活高達(dá)2220.41 U/g，酸性蛋白酶活為360.49 U/g，為最優(yōu)比例，根據(jù)此結(jié)果，選取最優(yōu)比例的復(fù)配菌株進(jìn)行大生產(chǎn)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 A2、B2復(fù)配大生產(chǎn)試驗(yàn)酶活測(cè)定Table 2 The determination of enzyme activity of A2, B2 complex production test

對(duì)照組為米曲霉滬釀3.042菌株發(fā)酵成曲，由表2可知，在雜菌數(shù)差異不明顯的情況下，試驗(yàn)組的中性蛋白酶活力與酸性蛋白酶活力均高于對(duì)照組，黃曲霉毒素B1(AFB1)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。后續(xù)的理化指標(biāo)待檢測(cè)。

2.4 醬油理化指標(biāo)檢測(cè)

根據(jù)生產(chǎn)菌株和A2、B2單株發(fā)酵及其復(fù)配成曲的蛋白酶活力，對(duì)180 d發(fā)酵后醬油主要理化特性進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，結(jié)果見圖2。

圖2 大生產(chǎn)試驗(yàn)成曲蛋白酶活及其發(fā)酵醬油理化特性主成分分析Fig.2 Principal component analysis of protease activity of finished koji and physicochemical properties of fermented soy sauce

由圖2可知 ，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的方差貢獻(xiàn)率分別為95.1%和3.7%，可以反映不同樣品的理化性質(zhì)的主要信息。

成曲的蛋白酶酶活、醬油總酸、氨氮、全氮、酒度及谷氨酸含量均在PC1中方差貢獻(xiàn)率較大。通過對(duì)大生產(chǎn)試驗(yàn)的上述指標(biāo)綜合分析，表明將菌株A2、B2按照1∶9的比例復(fù)配后發(fā)酵制曲所釀造醬油成品(發(fā)酵180 d)的穩(wěn)定性較好。復(fù)配試驗(yàn)組成品醬油的谷氨酸含量均遠(yuǎn)高于菌株A2、B2單獨(dú)發(fā)酵所得樣品，且氨氮平均值為1.21。同時(shí)現(xiàn)有的生產(chǎn)菌株制曲所產(chǎn)孢子數(shù)約為試驗(yàn)組的100倍。

3 結(jié)論

我國(guó)是醬油的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，篩選更優(yōu)微生物、提高產(chǎn)品品質(zhì)對(duì)企業(yè)尤為重要。在制取過程中提高米曲霉的蛋白酶、谷氨酰胺酶等酶活力不僅能提高原料利用率，降低生產(chǎn)成本，還能產(chǎn)生更多的游離氨基酸和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為醬油的后期發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。而選取高酶活、低產(chǎn)孢子的米曲霉菌株則為工廠的操作和后期的清潔提供了便利。本研究選取產(chǎn)孢量少的兩株米曲霉菌株A2、B2復(fù)合發(fā)酵制曲(A2∶B2為1∶9)，其成曲相關(guān)酶活遠(yuǎn)高于該菌株單獨(dú)發(fā)酵后成曲酶活，且復(fù)合發(fā)酵后成曲的酸性蛋白酶活力遠(yuǎn)高于米曲霉滬釀3.042菌株制曲酶活。通過大生產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)酵180 d后制得的成品醬油性質(zhì)相對(duì)較穩(wěn)定，氨氮含量高于現(xiàn)有樣品，為復(fù)配發(fā)酵的普遍適用提供了理論依據(jù)。